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Azure Sapphire™NIR-Q使多重Western blotting標準化變得輕而易舉

現(xiàn)代數(shù)字檢測儀器對于western blotting不僅僅是檢測“有或沒有”的技術，還可以進行western blotting重復性和定量的檢測。在檢測方法的線性動態(tài)范圍，對數(shù)據(jù)進行標準化以控制蛋白上樣量和膜轉印帶來的變化，可以獲得真正的定量結果。 但是，對蛋白印跡進行標準化的**方法是什么？ 過去，金標準標準化方法是使用看家蛋白，基于這些蛋白在不同實驗條件下和細胞系中表達一致的假設。 然而，*近的研究表明，這種假設并不總是正確的，導致相對蛋白豐度的測量結果不準確。 相反，定量Western blotting專家和他們發(fā)表的期刊正在推薦一種新的金標準用于標準化，總蛋白定量 - 通過在膜上染色，檢測每個泳道的總蛋白進行標準化分析。

Azure Biosystems™的Sapphire™NIR-Q多功能激光生物分子成像系統(tǒng)具有兩個用于近紅外熒光檢測（700nm和800nm）的通道和用于檢測總蛋白專用的第三通道，使多重Western blotting標準化變得輕而易舉。

您可以繼續(xù)使用相同的NIR染料，同時加入總蛋白質染色劑，例如我們的低背景和易于使用的AzureRed試劑。 無需剝離和重孵育能夠檢測兩種不同的蛋白和總蛋白信號。

> 定量更準確

> 檢測更靈活

> 平臺設計更靈活

> 模塊化設計

使用看家蛋白進行標準化

使用看家蛋白**缺點是在樣品間和不同條件下表達水平可能不一致。如使用看家蛋白進行標準化，必須先花費時間和精力來驗證蛋白的選擇，并且可能需要檢查多種潛在的標準品，然后才能找到一種在所有樣品中真正表達同一水平，并且在不同實驗條件下不會發(fā)生變化的標準品。

使用看家蛋白的第二個重大挑戰(zhàn)是它們的表達豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，因為需要保留看家蛋白在線性檢測范圍內(nèi)并且不會使看家蛋白的信號飽和。 如果感興趣的蛋白不是同樣高度表達，這兩種蛋白質不在同一線性檢測范圍內(nèi)。

如果您正在進行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復雜性。

*后，檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。 當實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這變得越來越困難。

圖1.與常見的看家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動態(tài)范圍

單色通道圖像A）AzureRed染色總蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。 AzureRed信號的優(yōu)異動態(tài)范圍

與實際加載的蛋白量顯示在圖像（A）中。使用AzureSpot軟件定量來自總蛋白和看家蛋白的信號，并將得到的值

相對于每個樣品加載的蛋白量（E）作圖。與常見的看家蛋白相比，AzureRed表現(xiàn)出更強的相關性和更廣泛的動態(tài)范圍。

使用總蛋白進行標準化

使用總蛋白標準化，不是試圖找到可以代表轉移到膜上的樣品總量的蛋白，而是直接在膜上測量總蛋白，并且該值在標準化時用作分母。許多總蛋白染色劑可用于染色凝膠和膜。總蛋白染色提供更寬的動態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更清楚的數(shù)據(jù)。

總蛋白標準化比使用看家蛋白質快得多，特別是對于化學發(fā)光印跡，因為相對于剝離和重孵育染色步驟花費較少的時間。 理想情況下，在免疫檢測之前或之后，在膜上進行總蛋白染色。使用一些染色劑如AzureRed Fluorescent Total Protein Stain，可以在免疫檢測前對印跡進行染色，然后與目的蛋白同時對總蛋白進行成像。 通過這種*簡單的工作流程，目的蛋白和總蛋白的圖像會自動對齊。

與使用看家蛋白相比，圖像捕獲后的分析工作流程基本不變；整個泳道或泳道中大部分信號用于標準化，而不是單一的條帶。

用總蛋白染色劑對膜進行染色提供了額外的質控優(yōu)勢，可以驗證轉印是否完全。

使用AzureRed進行的總蛋白質標準化很容易適合任何蛋白質印跡工作流程