共振質量測試法在生物制藥開發(fā)中的應用
作者：Lisa Newey-Keane博士，馬爾文儀器生物制藥產(chǎn)品經(jīng)理
預測和測量蛋白質聚集，是生物制藥配方中的一個重大難題。Lisa Newey-Keane博士描述了一種新型分析方法，可以方便地研究蛋白質的聚集。
由于在藥物研發(fā)總體經(jīng)費支出中，生物分子研究工作所占的比重越來越大，因此分析測試在迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)受到廣泛關注。這些分子開發(fā)不僅成本高昂，而且受到嚴格監(jiān)管，所以急需更適合、更嚴謹?shù)姆治鰷y量方法。很多業(yè)內人士都提到，分析瓶頸是一個很令人擔心的問題，可能會限制藥物的開發(fā)。
與小分子藥物不同，蛋白質制劑是非合成或非結晶的，且本質上是不均勻的。正因為如此，對生物療法的純度和效力做出判定，要比對非生物分子復雜得多。例如，雜質來源繁多，包括以聚集體、錯誤折疊構象，或是以完全變性結構形式存在的生物分子。因此，用于保證和控制質量并提供預配方和配方必要數(shù)據(jù)所需的分析技術與制藥業(yè)中的用于小分子藥物的分析技術完全不同。這種復雜性和多變性，不僅給制造商，同樣也給監(jiān)管機構帶來了許多新的挑戰(zhàn)。
挑選合適的候選分子會在其它分析中涉及各種物理化學測試過程，以排除那些有可能成為下游“問題分子”的分子。其中一個需要回答的最重要的問題是，這些分子將會在配方中有怎樣的表現(xiàn)。而值得關注的重要領域是蛋白質聚集體，以及聚集可能引發(fā)的免疫反應。監(jiān)管機構已經(jīng)明確表達了對直徑為0.2微米至2微米的蛋白質聚集體造成的潛在免疫原性的關注，但現(xiàn)有的粒徑測定技術，尚不足以提供這一范圍的量化數(shù)據(jù)。它們可以讓你知道有這種粒徑的粒子存在，但無法確定存在的數(shù)量。被應用于馬爾文阿基米德系統(tǒng)的諧振質量測定（RMM ）技術能彌補這一缺陷，因為它不僅可以進行粒徑測量，更重要的是能對直徑為50納米 - 5微米的粒子進行計數(shù)。
技術簡介
共振質量測量主要是依靠一個可以檢測質量變化的機械共振結構。質量增加或減少，可以使結構的共振頻率上升或下降。由于可對頻率進行非常精確的測定，這就為測量質量提供了基礎。為了測量懸浮在液體上的微小顆粒的質量，共振器內置了微流體通道。當懸浮顆粒通過該結構時，它會改變共振器的整體質量，由此改變其共振頻率。
通過測量共振頻率對基準線的偏移，可以實現(xiàn)對粒子質量的測量。對于具有上浮力的微粒，如油滴（見下文），則可以觀測到相反的效果，共振頻率會相對于基準線發(fā)生正偏移。
采用共振質譜測量非常小的顆粒，需要使用自身質量很小的共振器。在馬爾文阿基米德系統(tǒng)中，MEMS（微機電系統(tǒng)）傳感器能滿足這一要求。每個傳感器芯片包括一個微流體網(wǎng)絡和一個微小的懸臂，以一個特定的頻率發(fā)生共振。懸臂中內置一個微流體通道。當儀器中的流體系統(tǒng)將樣品推送經(jīng)過通道時，懸臂的共振頻率會發(fā)生變化。共振頻率的變化通過激光測量，先聚焦到懸臂的頂端，然后將其發(fā)送到一個分離光電二極管探測器。
每個粒子穿過傳感器都會引起一次共振頻率的變化，從而得到對樣品中單個顆粒浮力質量精準的測量，無論這個數(shù)據(jù)是正是負。通過這樣的測量，可以計算出粒子的質量、粒徑（等效球）以及表面積。同時也可對樣品濃度、密度、體積和多分散性進行整體測量。
蛋白質聚集體的定量測量
起初，蛋白質聚集體處于二聚體水平，此后直徑一路攀升到數(shù)十微米，高于這一范圍上部的聚集體通常采用流量式顯微鏡來測量。共振質量測量可應用于低于流式顯微鏡測量范圍的領域，包括那些粒徑在亞微米至幾微米、以及不易通過其他方法評估定量評估測量的粒徑。這也是免疫原性的影響之處，以及新的監(jiān)管要求關注的地方。
使用RMM測量得出，粒徑大于300納米的聚集體濃度為每毫升4×106。因為測量是基于質量的，粒度分布可以用形成每種聚集體的蛋白質分子（已知質量的）數(shù)量來表示。在整個實驗過程中，從300nm到1μm范圍內聚集體的濃度在增長。這種尺寸的聚集體出現(xiàn)10倍的增加，大致對應一條聚集體級聯(lián)，而亞微米聚集體的濃度與壓力下制劑質量的不好有關。
檢測污染物
蛋白質制劑分析中另一個流行的課題是硅油，它通常作為潤滑劑，存在于盛制劑的注射器和容器中。硅油常常會混入制劑中，形成與聚集體大小接近的油滴。但主要問題不是生物相容性，因為硅油滴通常被認為是安全的。更大的問題在于，在某些測量方法中，油滴會被誤認為是蛋白聚集體，因此有可能影響結果的準確性。
RMM可以通過浮力測量將硅油滴與蛋白質聚集體區(qū)分開來。密度大于懸浮緩沖液的聚集體，是用頻率軌跡中的負峰值來表示。
硅油滴的密度一般比緩沖液的密度低，會在頻率軌跡上形成正峰值，這是因為它們的存在降低了傳感器的整體質量，從而提高傳感器的共振頻率。每一組都提供了單獨的分布情況。
今日技術
常規(guī)分析儀器使用過程中， RMM技術應用和推行成功至為關鍵的原因，在于它解決了蛋白質聚集測量中的關鍵粒度范圍這一問題。同樣重要的是，在處理小劑量貴重材料時，只需100 μL粘度達到100 cP的樣品，且無需進行樣品制備，即可進行測量。
由于能對50納米至5微米尺寸范圍內的顆粒進行檢測并精確計數(shù)，以及對浮力質量、干質量和大小進行可靠測量，共振質譜測量成為蛋白特性鑒定極具吸引力的方案。有關配方和穩(wěn)定性的定量信息，可被轉化為對效能及其穩(wěn)定性的信息。目前，RMM已經(jīng)被用于生物制劑早期開發(fā)階段，對聚集體進行檢測和量化，這實現(xiàn)了“發(fā)現(xiàn)越早，代價越小”的理念。
馬爾文公司全新的生物科學開發(fā)計劃
在傳統(tǒng)模式下，要將一種分析儀器推向市場，并使其成為完善的最終產(chǎn)品，往往要耗時數(shù)年。但這種模式卻完全不適用于生物制藥部門，因為它往往只能回答時過境遷的問題。處于生物制藥研究最前沿的研究人員，需要能解決當前問題的分析工具；而對供應商的挑戰(zhàn)，則在于需要對未知領域進行預測，在這些領域，快速變化的分析和監(jiān)管要求不斷考驗相關參與者。因此有必要了解什么是可以測量的，什么樣的測量結果可以提供質量方面的有價預測信息，并預見未來所需要的測量。
馬爾文通過創(chuàng)建生物科學開發(fā)計劃，助力生物科學行業(yè)的飛速發(fā)展。該計劃旨在跟上生物制藥技術快速的發(fā)展步伐，并肩負起作為分析儀器制造商的責任，即針對迅速發(fā)展的分析和監(jiān)管挑戰(zhàn)，快速提供令人信服的解決方案。獲得成功的關鍵是以高度自信、開放的態(tài)度，展開高層次技術開發(fā)合作，并建立靈活的技術和產(chǎn)品開發(fā)流程，對確認的分析需求保持絕對的專注。
盡管生物科學開發(fā)計劃是馬爾文組織機構的一個組成部分，其運營卻是在華盛頓特區(qū)附近的工廠中開展。該計劃由馬爾文公司首席技術官E Neil Lewis 博士負責，他領導著一支由科學家、工程師和業(yè)務開發(fā)人員組成的專家小組。這些成員雖然分處各地，卻又緊密聯(lián)系于馬爾文核心團隊之中。他們專注于生物制藥行業(yè)的要求，尤其是有關配方和產(chǎn)品開發(fā)的生物化學和生物物理表征的需求。
這一對市場反應迅速、經(jīng)費充足且目標明確的計劃，將會促進生物制藥企業(yè)、技術創(chuàng)新者和領先學術機構之間的密切合作。通過建立這種互惠互利的關系，馬爾文可以實時了解新興產(chǎn)業(yè)的要求，并作出快速響應，生物制藥部門則可以盡早介入，并幫助設計它所亟需的前沿技術。該項合作的第一項成果，是達成了將馬爾文阿基米德系統(tǒng)推向市場的協(xié)議。隨著技術的進一步發(fā)展，今年會有完全成熟的產(chǎn)品推出。
欲了解有關馬爾文生物科學發(fā)展計劃的進一步信息，敬請聯(lián)系E. Neil Lewis博士
