庫爾特原理發(fā)明50周年
自從20世紀50年代中期發(fā)明庫爾特原理后，庫爾特原理成為了行業(yè)的根基，響應(yīng)了對自動化血細胞計數(shù)儀器的需求。華萊士•H. 庫爾特和他的兄弟小約瑟夫•R. 庫爾特提出了一種使細胞通過一個感測小孔的簡單想法以來，此行業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段。在第一個階段，華萊士希望將常規(guī)的紅血球計數(shù)工作變?yōu)樽詣硬僮鞯脑竿�，促成了上述簡單想法的提出、庫爾特原理的定義、此原理的專利獲得、其被美國國立衛(wèi)生研究院認可、以及在一次美國國家級研討會上對此原理進行了闡述。在第二個階段，庫爾特兄弟專注于商業(yè)化儀器的實用化，并專注于通過經(jīng)營公司來支持此儀器的生產(chǎn)和銷售。在第三個階段，針對感測孔功能特性引發(fā)的體積測定錯誤，進行了廣泛的研究；庫爾特兄弟不斷成長的公司找到了各種解決方案，從而開發(fā)了自動化越來越高的血液分析儀。目前此行業(yè)非常興旺，有好幾個公司參與其中。
簡介
“一個孔不可能獲得專利權(quán)”。幾個律師都持這種看法，拒絕受理華萊士•H. 庫爾特希望將紅血球計數(shù)的自動化方法申請專利的請求。1 對于每一份試樣，一名技術(shù)人員要花枯燥的30來分鐘，通過顯微鏡來計算標(biāo)準(zhǔn)容器中紅血球的數(shù)量，獲得的結(jié)果很少可復(fù)驗。自從華萊士（圖1）讀了Moldavan在1934年寫的筆記（其中建議在含有細胞的懸浮液流過一根安裝在顯微鏡處的毛細管時，采用光電方法對細胞進行計數(shù)）后，他非常希望能將這種計數(shù)工作自動化。10多年過去了，華萊士發(fā)現(xiàn)了一種更好的方法，而當(dāng)他準(zhǔn)備宣布此方法時，又一個10年過去了。
第一階段
通過在其它地方獲得了技術(shù)經(jīng)驗后，華萊士于1946年回到了芝加哥，此后他邀請了其兄弟小約瑟夫•R. 庫爾特（圖2）加入他的研究。他后來回憶了他們在一個地下室實驗室中的工作：3 “最開始的方法是對向下經(jīng)過毛細管、通過一條光束的血細胞計數(shù)，就像統(tǒng)計正走下走廊的人們的人數(shù)一樣。但我們沒有獲得非常好的感測信號，我們問自己這是為什么。除了調(diào)節(jié)光束的方法外，是否有其它方法由細胞的通過動作產(chǎn)生電脈沖信號？”盡管當(dāng)時我們不知道答案，但血細胞是絕緣體 – 因此我們通過調(diào)節(jié)電流而不是調(diào)節(jié)光束，而獲得了解決方案。
通過一項本質(zhì)上簡單的解決方案，華萊士在1947年已經(jīng)將毛細管的長度降到了最低。1“在我們開始時，我們沒有多少錢，我們在煙盒上取下的一張玻璃紙上，用加熱的針刺了一個小孔。雖然這種小孔維持不了多久，但我們對一些細胞進行了計數(shù)。”刺有小孔的玻璃紙通過橡膠圈固定而覆蓋在玻璃管的末端之上，并將連接在電源上的兩個電極分開，懸浮在離子介質(zhì)中的細胞和電流儀器流過刺有小孔的玻璃紙。一個細胞在此小孔中的液體排水量（等于其自身體積），與傳導(dǎo)電流流經(jīng)此小孔的兩個電極之間的電壓脈沖成正比。
庫爾特兄弟發(fā)現(xiàn)，細胞和懸浮介質(zhì)之間的電反差，是通過光電方法獲得的反差的10倍，通過所產(chǎn)生的電壓脈沖可非常容易地對流經(jīng)小孔的懸浮液中的細胞進行準(zhǔn)確計數(shù)。這項發(fā)現(xiàn)促使華萊士不惜花了非常長的時間來尋找一位愿意代辦專利權(quán)申請的律師。最后在1948年，有人介紹了Irving Silverman給他，后者認可了此項具有重大潛力的新方法。1949年，提交了專利權(quán)申請。
但專利權(quán)審查人員也懷疑是否可對一個孔能授予專利。幸運的是，他猜想如果可以提供一些應(yīng)用例子（而不僅僅提供“通過小孔的軸向電流和感測通道”這一原理），在對狹小電流通道中的粒子進行感測的原則基礎(chǔ)上，可以獲得專利。1 對橫穿小孔中懸浮液流的模擬通道進行了描述，還描述了具有非圓形橫截面的小孔。一根絕緣的針?biāo)褜し�(wěn)定懸浮液中經(jīng)過的粒子是另外一個例子；一個粒子的存在，是通過移動的針和接觸導(dǎo)電懸浮介質(zhì)的另一個電極之間電流中的脈沖來感測的。因此這樣定義了新的庫爾特原理，在50年前的1953年10月20日，授予了具有開創(chuàng)性的專利權(quán)，在試管的內(nèi)壁較低處形成的極微小孔為專利首先的實例。
同時，庫爾特兄弟繼續(xù)進行研發(fā)，重點在于使自動化變得可行。在Walte Hogg（約瑟夫在服役時的朋友）的無償幫助下，庫爾特兄弟組裝了一臺實驗性儀器（與海軍研究局簽訂的合同項目）：一個機械測量系統(tǒng)驅(qū)動受控制的一定量的細胞懸浮液流過小孔，同時一個連接器件向其提供電流，并通過具有可調(diào)閥值的電壓放大器感測所產(chǎn)生的信號脈沖。超過閥值的信號脈沖會觸發(fā)安裝在連接器件頂部的一個脈沖計數(shù)器（Berkeley科學(xué)模型410；貝克曼儀器公司，[當(dāng)時]在加州里士滿）。通過連續(xù)增加閥值，對樣本重復(fù)進行測試，可人工記錄細胞大小的累積分布。由于需要監(jiān)測小孔是否部分阻塞，因此加裝了一臺示波鏡，可以同時監(jiān)測信號脈沖和閥值的設(shè)定。
經(jīng)驗同樣告訴我們，需要對通過小孔后懸浮的細胞數(shù)量進行精確測量。庫爾特兄弟發(fā)明了一種很好的建立水銀壓力計基礎(chǔ)上的方法（見圖3）。約瑟夫一次這樣說道：“正是壓力計使得計數(shù)器工作。它很簡單、很容易控制、而且它能夠一直工作�！边@一測量系統(tǒng)加上一臺對準(zhǔn)著小孔的顯微鏡一起構(gòu)成一個樣品臺的基礎(chǔ)，它可以30年基本保持不變。1952年，制作了包含新的樣品臺的最早的兩架儀器；連接電子器件和示波器被集成到一個合成的控制臺上，其中還包括十進制計數(shù)器來累計電壓脈沖。1953年，這些儀器原型被送到美國國立衛(wèi)生研究院進行評估；1956年5月，對壓力計測量系統(tǒng)提出了專利申請。6
圖3 計數(shù)器樣品臺的功能示意圖 ，由庫爾特兄弟共同發(fā)明。6 當(dāng)管閂F打開時，壓力計儲液槽R中的水銀被連接至P的小型真空泵抽吸，所產(chǎn)生的壓力差會在管閂F關(guān)閉后使得水銀柱J移動，使樣品懸浮液E通過帶孔圓片A從樣品槽流入樣品管B中。帶孔圓片和樣品管有介電材料制成，其電阻率比懸浮介質(zhì)的電阻率要大得多。通過連接線H和I，電極C和D通過小孔將電流連接起來，且將所產(chǎn)生的信號脈沖送至放大器和脈沖計數(shù)器（沒有顯示）。需要分析的樣品的體積由三個控制電極(K, L, M)測定，這三個電極穿過了壓力計管的管壁；當(dāng)流動的水銀造成K和L之間有電接觸時，脈沖計數(shù)器啟動，而當(dāng)水銀與M接觸時會使計數(shù)器停止工作（M與L之間的距離經(jīng)過了校準(zhǔn)）。只有當(dāng)懸浮液以恒速流過小孔時才會對細胞進行計數(shù)，這樣使得可測定細胞的濃度，因為懸浮液體積等于電極L和M之間的水銀的體積。第二個管閂G只在下列情況下打開，即用清潔的懸浮介質(zhì)通過O來填充或沖洗樣品管時。觀察小孔的顯微鏡沒有顯示。以上內(nèi)容根據(jù)華萊士的論文改寫。
1956年華萊士其個人技術(shù)論文中正式宣布了庫爾特原理。7 “在新的計數(shù)器中，讓單個細胞穿過懸浮液中一個小的狹窄電流通路，然后檢測細胞和懸浮液各自導(dǎo)電性的差別。一個小的狹窄電流通路和光學(xué)系統(tǒng)中的一小束光線類似。在通過液體中小的電流路徑時，單個血細胞改變了電路中的電阻，使得穿過電流通路后電壓的下降發(fā)生了變化。小規(guī)模的電流通路和流過通路的含有細胞的液體流都具有簡單的結(jié)構(gòu)。電流通路的邊界就是一個絕緣容器內(nèi)壁上尺寸很小的潛孔口。” 在圖3中，該潛孔口即是帶孔圓片A上中心孔。
此后不久，出版了兩份美國國立衛(wèi)生研究院的評估報告。8,9 兩份報告都認為庫爾特方法在給紅細胞計數(shù)時提高了準(zhǔn)確性、有效性和方便性�？銎渲幸环菰u估報告的期刊同時也做了新的庫爾特計數(shù)器®的第一份廣告。另一份評估報告9 認為粒度分布上的偏斜度是細胞重合造成的，并提供了一種糾正重合造成的計數(shù)損失的人工方法。它還包含了白細胞計數(shù)的初步數(shù)據(jù)。
自動進行重要血液測試工作的可行性已經(jīng)得到證明，但商業(yè)化運作還未展開。牢固地固定小孔的工作還很困難。10 壓力計（用來測量通過小孔后懸浮物）中使用的水銀也是需要顧慮的事情，實驗性計數(shù)器中的機械系統(tǒng)就顯得尤為重要 。用來為小孔提供激勵電流的電壓源對小孔以及用來懸浮細胞的介質(zhì)的特征，都會產(chǎn)生無法接受的靈敏度。在美國國立衛(wèi)生研究院開展的研究中，已經(jīng)確認需要自動稀釋計來精確地稀釋樣品。13 約瑟夫后來總結(jié)這十年來的準(zhǔn)備工作時說，“我們知道還有很多問題，但是我們已經(jīng)知道了一些有用的東西。”下一個十年就要開始了，很快在新申請的專利中都會有這些問題的解決方法。
第二階段
庫爾特計數(shù)器的核心是感測小孔（見圖3，圓片A上的小孔），它這時得到了庫爾特兄弟最多的關(guān)注。對于許多潛在的應(yīng)用來說，要求小孔直徑小于100 lm，允許的尺寸和形狀容差都很小。樣品試管壁上直接做成的小孔可重復(fù)性低，這樣就促使對玻璃帶孔圓片（形成毛細管的橫截面）進行實驗。但是用來固定圓片的接合劑沒有成功（無效），且如果將下孔焊接在樣品試管上，熱量會使得小孔扭曲變形。還試用了用作表軸承的環(huán)寶石，Hermann Foery（瑞士珠寶公司，位于瑞士洛迦諾市）提供了實驗用的寶石，用其做成了早期低噪聲小孔。與Sam Gutilla（美國伊利諾斯州芝加哥市Del Mar Scientific公司）合作，開發(fā)出一種將寶石焊接到樣品試管上的方法。寶石上精確的柱狀小孔不受焊接的影響，并為電流的流動和樣品懸浮液提供了持久耐用的管道。
到1958年底，對焊接有環(huán)寶石的可互換樣品試管（見圖3中的B）的提出了專利申請。10 所選寶石的厚度可以提供小孔長度直徑比約為0.75，這樣可以盡量減少基本專利4和美國國立衛(wèi)生研究院研究9中提到的微粒重合現(xiàn)象。到了1958年，庫爾特兄弟已經(jīng)準(zhǔn)備好創(chuàng)立庫爾特電子公司，以及庫爾特銷售公司。母公司最早的兩名全職員工是長期提供義務(wù)服務(wù)的小約瑟夫 R.庫爾特和沃爾特•豪格（Walter Hogg）。庫爾特兄弟的父親最初只是周末到公司來做兼職的秘書和會計工作，但此時他已經(jīng)68歲了，他從鐵路報務(wù)員的崗位上退休，和他的兒子們一起工作，一直到1971年才部分退休。沃爾特是第一個在公司工作達20年之久的員工，指定其為發(fā)明人的美國專利比指定華萊士為發(fā)明人的美國專利還多一些（各為95項專利和82項專利），沃爾特也是公司內(nèi)唯一比華萊士擁有更多專利的員工。
事后看來，1958年是一個重要的起點。Kilby發(fā)明了振蕩器——第一個集成電路。很快地，Noyce和Hoerni開發(fā)出平面工藝，使得微電子迅猛發(fā)展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光學(xué)頻率上工作的要求，在兩年后，Maiman發(fā)現(xiàn)了激光。所有這些發(fā)展都為新公司的未來起到了舉足輕重的作用。
開始時由Ernie Yasaka組裝原型的復(fù)制品14，也就是現(xiàn)在所說的A型庫爾特計數(shù)器®，由華萊士進行銷售。為了可用于工業(yè)目的15 ，在樣品臺上添加了一個攪拌器（見圖4）。新公司立即需要關(guān)注的是一篇論文證實脈沖幅度和顆粒體積之間有正相關(guān)關(guān)系。通過將一個庫爾特計數(shù)器®和具有雙可變脈沖閾值的單通道脈沖－高度分析器（PHA）進行連接，Kubitschek獲得了第一個微分粒度分布；這樣就凸顯出A型計數(shù)器的兩個缺點：第一，它單一的閾值需要通過連續(xù)增加閾值進行多次樣品測試來獲得累積粒度分布14,16，而且需要大量的時間和計算來人工獲得微分粒度分布。很明顯，非常需要自動化方法進行粒度分析；第二個缺點是，用于提供小孔電流的電壓源使得脈沖幅度對于特定小孔的大小、特定懸浮介質(zhì)的電阻系數(shù)以及特定懸浮介質(zhì)中溫度引起的變化都很敏感14,15，這些都使精確計數(shù)和粒度分析變得復(fù)雜。
圖4 A型庫爾特計數(shù)器，帶工業(yè)用途樣品臺（圖3），右邊所示。樣品臺右上側(cè)的黑色圓形物體為攪拌器馬達，用于使工業(yè)用途粒子保持在懸浮液中；在血細胞計數(shù)時，樣品架上不會使用攪拌器�？刂婆_從左到右包括：機械計數(shù)器（用于慢速累計的高值數(shù)字），三個十進制計數(shù)器（用于快速累計的低值數(shù)字），以及示波鏡顯示管。單閥值和小孔電流的控制裝置在顯示管治下。
在白細胞計數(shù)上取得了良好的成果后17，公司在1960年引進了一種改進的儀器18 ，旨在進一步對細胞和顆粒大小進行精確的測量。使用電流源對小孔進行激勵代替了原來的電壓源，而用來感測顆粒脈沖的雙閾值電流靈敏放大器代替了原來的單閾值電壓放大器。因此，B型庫爾特計數(shù)器對限制A型計數(shù)器的那些因素不敏感，它的雙閾值聯(lián)鎖，形成了一種可移動的通道，由定序四秒計時器來控制。它附屬的H型分布繪圖儀20可以從100秒樣品運行中自動累計25個通道的微分粒度分布18。C型庫爾特計數(shù)器的開發(fā)也取得了進展——它的原型包括12通道的脈沖－高度分析器。它的350多個真空管可以給公司的設(shè)施供暖，它的體形巨大，搬運時需要拆開。到1961年，當(dāng)公司從芝加哥搬到佛羅里達州的Hialeah時，C型庫爾特計數(shù)器已經(jīng)小到可以放在桌面上了。
20世紀60年代，在紅細胞和白細胞7,18,22–28的計數(shù)和大小測量上，A型和B型計數(shù)器都證明很有用（見評論25,27），而且在微生物學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域粒度分析上也獲得了應(yīng)用31 。但同時，也產(chǎn)生了擔(dān)憂。1959年，按照庫爾特原則設(shè)計了一種商用型儀器。32 1960年，美國國立衛(wèi)生研究院研究中9所發(fā)現(xiàn)的非對稱分布得到了證實。笨重的稀釋器促使一位客戶自己設(shè)計更好用的儀器22。1962年，發(fā)現(xiàn)感測小孔的長度直徑比影響粒度分析的分辨率。34 一家公司（后來成為庫爾特兄弟公司的競爭對手）就庫爾特原則的一種衍生模式35申請了專利，而庫爾特銷售公司的一名主管自己也申請了一種衍生樣品管的專利36，他后來離開了庫爾特公司，也成為了庫爾特公司的競爭對手37。此外，早期的血小板計數(shù)實驗也遇到了沒有預(yù)想到的干擾，干擾顯然來自相位顯微鏡無法發(fā)現(xiàn)的小顆粒38。
Lushbaugh等人將100通道的PHA和A型庫爾特計數(shù)器39,40連接在一起，提高了測量的成本。很快，幾家公司都把為特定目的制作的庫爾特顆粒感測器和商用型PHA連接在一起，可以提供多達512個通道29。體積測量工具的可用性和復(fù)雜度越來越高，使得在測量各種細胞和顆粒的粒度分布上，使用人工工具越來越明顯1。華萊士這樣評論說，“面臨挑戰(zhàn)也很好，我們肯定能夠分享一部分好處�！�
第三階段
感測小孔（見圖3帶孔圓片上的小孔）是庫爾特原理的核心，設(shè)計一個庫爾特計數(shù)器，自動彌補其功能特點上的不足，現(xiàn)在成為首要任務(wù)。美國國立衛(wèi)生研究院的研究注意到，感測小孔的敏感量是幾何小孔的三倍，這是激勵電流流過樣品容器和樣品管中懸浮介質(zhì)所產(chǎn)生的電場的結(jié)果（見圖3）。量測系統(tǒng)產(chǎn)生的類似水動力場使得細胞（或粒子）通過感測小孔時，細胞（或顆粒）和電場產(chǎn)生相互作用。對于兩種小孔場來說，重要的顆粒相互作用是發(fā)生在包含感測小孔的敏感體積內(nèi)，而且從小孔入口和出口處成半橢圓形向外延伸到三到四倍小孔直徑的距離處。
因此，通過排出和細胞相同體積量的導(dǎo)電懸浮媒介，每個細胞在它的范圍內(nèi)扭曲了電場——特別是在通過感測小孔時。結(jié)果是，細胞的體積和小孔的相當(dāng)。小孔電阻的變化（通常是50,000分之一），以及通過小孔時帶來的電阻的細小變化，產(chǎn)生了信號脈沖，這樣就能夠進行細胞計數(shù)和測量大小。要達到精確的計數(shù)和可重復(fù)的大小量測，要求通過小孔的懸浮流非常平穩(wěn)。
和離子電流不同，由于懸浮介質(zhì)的聚集和黏性，懸浮液流受到感測小孔表面慣性和邊界層的影響。結(jié)果是，這些對小孔和它的兩個孔口產(chǎn)生微幾何學(xué)反應(yīng)50 ，在小孔軸心中點周圍產(chǎn)生不對稱的動力流場。在出口孔洞產(chǎn)生的環(huán)型流體將顆粒帶回小孔的感測體積內(nèi)，這樣會產(chǎn)生二次脈沖，導(dǎo)致錯誤的顆粒計數(shù)結(jié)果。例如，沃爾特•豪格在一次早期的血小板研究中發(fā)現(xiàn)38，所遇見的假微粒是那些重新進入感測體積內(nèi)的紅細胞，二次脈沖使它們重新被計作血小板。將顆粒從出口孔帶走的輔助流可以防止顆粒循環(huán)和二次脈沖。
一直認為同時通過小孔敏感體積的細胞通過屏蔽顆粒脈沖會減少細胞計數(shù)4,7，但計數(shù)上的損失可以通過懸浮液中細胞濃度從統(tǒng)計學(xué)角度預(yù)測出來9,52–60。因此，單通道計數(shù)可以通過合適的電路自動糾正61，最新一個版本的D型庫爾特計數(shù)器介紹了這一方法。然而，同時通過的顆粒產(chǎn)生的非典型脈沖還導(dǎo)致了粒度分布變寬45，典型紅細胞粒度分布出現(xiàn)不對稱39–41,44,62。在美國國立衛(wèi)生研究院的研究中9把這種不對稱歸為粒子重合，但很快在其它細胞類型38和粒子的粒度分布中也發(fā)現(xiàn)了這種不對稱31,63,64。在提高測定體積的準(zhǔn)確性后，紅細胞的粒度分布被證實呈雙峰性40,41,65。這些分布假象都造成尺寸測量的分辨率降低。
到20世紀60年代后期，與體積測定產(chǎn)生假象的原因有關(guān)的研究迅速發(fā)展28,30,44,45,49,65–78，幾個研究單位根據(jù)庫爾特原理建立起實驗系統(tǒng)。顆粒以離軸不同的徑向距離通過感測小孔時，會出現(xiàn)麻煩的粒度分布假象。在低有效顆粒濃度下，長度是直徑幾倍的小孔可以提高測量分辨率34,41,67,80，圍繞一個更小懸浮液流的輔助流可以水動力方式將通過小孔的顆粒集中在軸附近。在典型的顆粒濃度下，在小孔中心點對信號脈沖抽樣，或者按照持續(xù)時間對信號脈沖進行選擇，可以大大提高體積測定的精確度（見概覽65,67,78,86–88）。
對小孔功能特性進行研究的一個重要結(jié)果就是發(fā)明了第一個細胞分類器48,70,89–91，它可以判斷紅細胞雙峰分布是事實還是假象。Fulwyler將庫爾特原理和噴墨技術(shù)相結(jié)合，并使用該成果將細胞從單一的分布模式中挑選出來。當(dāng)挑選出來的紅細胞被重新測定大小后，結(jié)果表明原來的雙峰形式是一種假象。
在這次研究大發(fā)展中，庫爾特計數(shù)器的型號隨著電子學(xué)的發(fā)展而發(fā)展，裝有晶體管的F型和C型同時替代了A型。樣品臺進行了改裝，J型分布繪圖儀代替了H型分布繪圖儀。1968年下半年，出現(xiàn)了第一個自動化的血液分析計94——7個參數(shù)的S型庫爾特計數(shù)器®。同時，裝有晶體管的T型庫爾特計數(shù)器®代替了C型庫爾特計數(shù)器®，用于工業(yè)目的。在集成電路的基礎(chǔ)上，1970年推出了Z系列計數(shù)器。1972年出現(xiàn)了Channelyzer®體積分析儀，同時還出現(xiàn)了工業(yè)用TA系列分析儀，它包含了計數(shù)器和16通道PHA電路。隨后不久，這些儀器都開始采用微處理器。
華萊士經(jīng)常評論說1，“只要它是有用的，人們就會購買。”隨著產(chǎn)品的不斷改進，銷售量也越來越大。
2000年以后出品的Multisizer系列在工業(yè)、生物等各領(lǐng)域具有不可替代的地位，源自于該型號具備極高的分辨率，并可依據(jù)其最新開發(fā)的DPP處理器，單獨分析個體顆粒的脈沖信號，使得對測量全過程顆粒或細胞的體積或粒徑的變化的監(jiān)控成為可能。該脈沖處理器的技術(shù)的誕生也使得粒度分析儀領(lǐng)域添加了一項獨一無二的過程監(jiān)控功能（圖五）。
概要
開始是個不能獲得專利的小孔，卻促成了一個原理的發(fā)現(xiàn)，且獲得了專利。庫爾特原理的發(fā)現(xiàn)來自華萊士將辛苦的例行工作變?yōu)樽詣踊僮鞯脑竿�，庫爾特原理提供了一種可重復(fù)的對細胞或顆粒體積（恰當(dāng)校準(zhǔn)時）進行物理測量的方法，此原理還促進發(fā)明了一系列越來越復(fù)雜的自動化工具。使用庫爾特原理的儀器被廣泛接受，這使得其它一些公司也紛紛開發(fā)出類似的工具。庫爾特原理仍然是測量顯微顆粒體積的方法之一，已經(jīng)在許多科學(xué)領(lǐng)域被包括在各類標(biāo)準(zhǔn)中。到20世紀80年代后期，僅美國就有5萬多種庫爾特計數(shù)器在使用。描述其實際應(yīng)用和理論設(shè)計的刊物現(xiàn)在數(shù)以千計，相關(guān)的專利也有好幾百種。
在華萊士的基本專利中，4 他通過兩種形式的感測小孔（都是使用介電材料）定義了他的原理。他更喜歡軸向激勵/感測這種形式，因為它更容易生產(chǎn)，且產(chǎn)生的是線性體積反應(yīng)。有趣的是，由于在導(dǎo)電材料上形成的電偶層暴露在離子介質(zhì)中的電場內(nèi)，即便是小孔是在導(dǎo)電材料中形成的110,111，上述形式也可以奏效。所產(chǎn)生的信號脈沖除了能反映顆粒的體積，也能反映顆粒的電氣化學(xué)性質(zhì)、包含感測小孔的材料以及懸浮介質(zhì)。如果感測小孔是以混合結(jié)構(gòu)材料中制成，包括兩種傳導(dǎo)材料中華萊士原有孔洞，這種軸向形式也同樣奏效。由于顆粒要么在小孔出口再循環(huán)，要么遠離軸而通過孔洞，因此所獲粒度分布產(chǎn)生的假象最少。
庫爾特原理的軸向?qū)嵤┠Ｊ狡褚呀?jīng)獲得了廣泛的關(guān)注，但是由于熱噪聲的原因，使得將其尺寸縮小的努力遇到了瓶頸。原則上來說，第二種形式采用橫穿懸浮流的激勵和感測，這樣可以感測到更小的顆粒，但代價是要求體積線性化（基于選定形狀的小孔和電極）。35,113–115
庫爾特原理第四階段的發(fā)展是包括以上所說的這些，還是將新出現(xiàn)的科學(xué)技術(shù)和已有的技術(shù)相結(jié)合，我們拭目以待。
后記
當(dāng)庫爾特在努力領(lǐng)悟怎樣發(fā)現(xiàn)庫爾特原理時，他的父親為兄弟倆寫了這樣一首詩：
為什么不去導(dǎo)引它，它在你的掌握之中，你能哺育和引導(dǎo)它，你能達到你的目標(biāo)！充分利用這一天分，讓它朝好的方向努力。你的思想就是你的生命；天才利用它——你也一樣！
這出分為三幕的戲劇（本文的三個階段）表明他和約瑟夫都很好地領(lǐng)會了父親的建議。華萊士看不到問題，但他能發(fā)現(xiàn)很多機會。他的發(fā)明洞察力在科學(xué)界得到廣泛的認同。約瑟夫能發(fā)現(xiàn)問題但是他把這些問題看作是挑戰(zhàn)。他在技術(shù)和商業(yè)領(lǐng)域都是一個執(zhí)行者。兄弟倆都相信科學(xué)應(yīng)該服務(wù)于人，他們倆互補，成功地為當(dāng)今科學(xué)設(shè)備的發(fā)展作出了貢獻。他們的努力所產(chǎn)生的人文價值勿庸置疑。
盡管他們?nèi)〉昧嗽S多成就，庫爾特兄弟（見圖6）仍然保持謙虛，并對革新性的思想保持熱情。他們對家庭十分投入，這也包括他們的雇員和朋友。兩人將自己的時間、經(jīng)驗和知識都無私地與他人分享。兩人都十分自立，但在一個難以達到的目標(biāo)上又相互支持幫助。當(dāng)他們付出的某次愿望良好的努力難以達到預(yù)期目標(biāo)，而且代價昂貴時，華萊士解釋說，“不嘗試的人是不會犯錯誤的”，而約瑟夫補充說，“有些東西是比金錢更重要的。”
一個人能有一位良師是幸運的。而那些有幸和庫爾特兄弟一起工作的人擁有了兩位良師。這篇簡短的回顧文章是為了紀念杰出的兄弟倆，他們總是喜歡努力做得更好，也鼓勵自己做得更好。(編輯整理：陳衛(wèi))
自從20世紀50年代中期發(fā)明庫爾特原理后，庫爾特原理成為了行業(yè)的根基，響應(yīng)了對自動化血細胞計數(shù)儀器的需求。華萊士•H. 庫爾特和他的兄弟小約瑟夫•R. 庫爾特提出了一種使細胞通過一個感測小孔的簡單想法以來，此行業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段。在第一個階段，華萊士希望將常規(guī)的紅血球計數(shù)工作變?yōu)樽詣硬僮鞯脑竿�，促成了上述簡單想法的提出、庫爾特原理的定義、此原理的專利獲得、其被美國國立衛(wèi)生研究院認可、以及在一次美國國家級研討會上對此原理進行了闡述。在第二個階段，庫爾特兄弟專注于商業(yè)化儀器的實用化，并專注于通過經(jīng)營公司來支持此儀器的生產(chǎn)和銷售。在第三個階段，針對感測孔功能特性引發(fā)的體積測定錯誤，進行了廣泛的研究；庫爾特兄弟不斷成長的公司找到了各種解決方案，從而開發(fā)了自動化越來越高的血液分析儀。目前此行業(yè)非常興旺，有好幾個公司參與其中。
簡介
“一個孔不可能獲得專利權(quán)”。幾個律師都持這種看法，拒絕受理華萊士•H. 庫爾特希望將紅血球計數(shù)的自動化方法申請專利的請求。1 對于每一份試樣，一名技術(shù)人員要花枯燥的30來分鐘，通過顯微鏡來計算標(biāo)準(zhǔn)容器中紅血球的數(shù)量，獲得的結(jié)果很少可復(fù)驗。自從華萊士（圖1）讀了Moldavan在1934年寫的筆記（其中建議在含有細胞的懸浮液流過一根安裝在顯微鏡處的毛細管時，采用光電方法對細胞進行計數(shù)）后，他非常希望能將這種計數(shù)工作自動化。10多年過去了，華萊士發(fā)現(xiàn)了一種更好的方法，而當(dāng)他準(zhǔn)備宣布此方法時，又一個10年過去了。
第一階段
通過在其它地方獲得了技術(shù)經(jīng)驗后，華萊士于1946年回到了芝加哥，此后他邀請了其兄弟小約瑟夫•R. 庫爾特（圖2）加入他的研究。他后來回憶了他們在一個地下室實驗室中的工作：3 “最開始的方法是對向下經(jīng)過毛細管、通過一條光束的血細胞計數(shù)，就像統(tǒng)計正走下走廊的人們的人數(shù)一樣。但我們沒有獲得非常好的感測信號，我們問自己這是為什么。除了調(diào)節(jié)光束的方法外，是否有其它方法由細胞的通過動作產(chǎn)生電脈沖信號？”盡管當(dāng)時我們不知道答案，但血細胞是絕緣體 – 因此我們通過調(diào)節(jié)電流而不是調(diào)節(jié)光束，而獲得了解決方案。
通過一項本質(zhì)上簡單的解決方案，華萊士在1947年已經(jīng)將毛細管的長度降到了最低。1“在我們開始時，我們沒有多少錢，我們在煙盒上取下的一張玻璃紙上，用加熱的針刺了一個小孔。雖然這種小孔維持不了多久，但我們對一些細胞進行了計數(shù)。”刺有小孔的玻璃紙通過橡膠圈固定而覆蓋在玻璃管的末端之上，并將連接在電源上的兩個電極分開，懸浮在離子介質(zhì)中的細胞和電流儀器流過刺有小孔的玻璃紙。一個細胞在此小孔中的液體排水量（等于其自身體積），與傳導(dǎo)電流流經(jīng)此小孔的兩個電極之間的電壓脈沖成正比。
庫爾特兄弟發(fā)現(xiàn)，細胞和懸浮介質(zhì)之間的電反差，是通過光電方法獲得的反差的10倍，通過所產(chǎn)生的電壓脈沖可非常容易地對流經(jīng)小孔的懸浮液中的細胞進行準(zhǔn)確計數(shù)。這項發(fā)現(xiàn)促使華萊士不惜花了非常長的時間來尋找一位愿意代辦專利權(quán)申請的律師。最后在1948年，有人介紹了Irving Silverman給他，后者認可了此項具有重大潛力的新方法。1949年，提交了專利權(quán)申請。
但專利權(quán)審查人員也懷疑是否可對一個孔能授予專利。幸運的是，他猜想如果可以提供一些應(yīng)用例子（而不僅僅提供“通過小孔的軸向電流和感測通道”這一原理），在對狹小電流通道中的粒子進行感測的原則基礎(chǔ)上，可以獲得專利。1 對橫穿小孔中懸浮液流的模擬通道進行了描述，還描述了具有非圓形橫截面的小孔。一根絕緣的針?biāo)褜し�(wěn)定懸浮液中經(jīng)過的粒子是另外一個例子；一個粒子的存在，是通過移動的針和接觸導(dǎo)電懸浮介質(zhì)的另一個電極之間電流中的脈沖來感測的。因此這樣定義了新的庫爾特原理，在50年前的1953年10月20日，授予了具有開創(chuàng)性的專利權(quán)，在試管的內(nèi)壁較低處形成的極微小孔為專利首先的實例。
同時，庫爾特兄弟繼續(xù)進行研發(fā)，重點在于使自動化變得可行。在Walte Hogg（約瑟夫在服役時的朋友）的無償幫助下，庫爾特兄弟組裝了一臺實驗性儀器（與海軍研究局簽訂的合同項目）：一個機械測量系統(tǒng)驅(qū)動受控制的一定量的細胞懸浮液流過小孔，同時一個連接器件向其提供電流，并通過具有可調(diào)閥值的電壓放大器感測所產(chǎn)生的信號脈沖。超過閥值的信號脈沖會觸發(fā)安裝在連接器件頂部的一個脈沖計數(shù)器（Berkeley科學(xué)模型410；貝克曼儀器公司，[當(dāng)時]在加州里士滿）。通過連續(xù)增加閥值，對樣本重復(fù)進行測試，可人工記錄細胞大小的累積分布。由于需要監(jiān)測小孔是否部分阻塞，因此加裝了一臺示波鏡，可以同時監(jiān)測信號脈沖和閥值的設(shè)定。
經(jīng)驗同樣告訴我們，需要對通過小孔后懸浮的細胞數(shù)量進行精確測量。庫爾特兄弟發(fā)明了一種很好的建立水銀壓力計基礎(chǔ)上的方法（見圖3）。約瑟夫一次這樣說道：“正是壓力計使得計數(shù)器工作。它很簡單、很容易控制、而且它能夠一直工作�！边@一測量系統(tǒng)加上一臺對準(zhǔn)著小孔的顯微鏡一起構(gòu)成一個樣品臺的基礎(chǔ)，它可以30年基本保持不變。1952年，制作了包含新的樣品臺的最早的兩架儀器；連接電子器件和示波器被集成到一個合成的控制臺上，其中還包括十進制計數(shù)器來累計電壓脈沖。1953年，這些儀器原型被送到美國國立衛(wèi)生研究院進行評估；1956年5月，對壓力計測量系統(tǒng)提出了專利申請。6
圖3 計數(shù)器樣品臺的功能示意圖 ，由庫爾特兄弟共同發(fā)明。6 當(dāng)管閂F打開時，壓力計儲液槽R中的水銀被連接至P的小型真空泵抽吸，所產(chǎn)生的壓力差會在管閂F關(guān)閉后使得水銀柱J移動，使樣品懸浮液E通過帶孔圓片A從樣品槽流入樣品管B中。帶孔圓片和樣品管有介電材料制成，其電阻率比懸浮介質(zhì)的電阻率要大得多。通過連接線H和I，電極C和D通過小孔將電流連接起來，且將所產(chǎn)生的信號脈沖送至放大器和脈沖計數(shù)器（沒有顯示）。需要分析的樣品的體積由三個控制電極(K, L, M)測定，這三個電極穿過了壓力計管的管壁；當(dāng)流動的水銀造成K和L之間有電接觸時，脈沖計數(shù)器啟動，而當(dāng)水銀與M接觸時會使計數(shù)器停止工作（M與L之間的距離經(jīng)過了校準(zhǔn)）。只有當(dāng)懸浮液以恒速流過小孔時才會對細胞進行計數(shù)，這樣使得可測定細胞的濃度，因為懸浮液體積等于電極L和M之間的水銀的體積。第二個管閂G只在下列情況下打開，即用清潔的懸浮介質(zhì)通過O來填充或沖洗樣品管時。觀察小孔的顯微鏡沒有顯示。以上內(nèi)容根據(jù)華萊士的論文改寫。
1956年華萊士其個人技術(shù)論文中正式宣布了庫爾特原理。7 “在新的計數(shù)器中，讓單個細胞穿過懸浮液中一個小的狹窄電流通路，然后檢測細胞和懸浮液各自導(dǎo)電性的差別。一個小的狹窄電流通路和光學(xué)系統(tǒng)中的一小束光線類似。在通過液體中小的電流路徑時，單個血細胞改變了電路中的電阻，使得穿過電流通路后電壓的下降發(fā)生了變化。小規(guī)模的電流通路和流過通路的含有細胞的液體流都具有簡單的結(jié)構(gòu)。電流通路的邊界就是一個絕緣容器內(nèi)壁上尺寸很小的潛孔口。” 在圖3中，該潛孔口即是帶孔圓片A上中心孔。
此后不久，出版了兩份美國國立衛(wèi)生研究院的評估報告。8,9 兩份報告都認為庫爾特方法在給紅細胞計數(shù)時提高了準(zhǔn)確性、有效性和方便性�？銎渲幸环菰u估報告的期刊同時也做了新的庫爾特計數(shù)器®的第一份廣告。另一份評估報告9 認為粒度分布上的偏斜度是細胞重合造成的，并提供了一種糾正重合造成的計數(shù)損失的人工方法。它還包含了白細胞計數(shù)的初步數(shù)據(jù)。
自動進行重要血液測試工作的可行性已經(jīng)得到證明，但商業(yè)化運作還未展開。牢固地固定小孔的工作還很困難。10 壓力計（用來測量通過小孔后懸浮物）中使用的水銀也是需要顧慮的事情，實驗性計數(shù)器中的機械系統(tǒng)就顯得尤為重要 。用來為小孔提供激勵電流的電壓源對小孔以及用來懸浮細胞的介質(zhì)的特征，都會產(chǎn)生無法接受的靈敏度。在美國國立衛(wèi)生研究院開展的研究中，已經(jīng)確認需要自動稀釋計來精確地稀釋樣品。13 約瑟夫后來總結(jié)這十年來的準(zhǔn)備工作時說，“我們知道還有很多問題，但是我們已經(jīng)知道了一些有用的東西。”下一個十年就要開始了，很快在新申請的專利中都會有這些問題的解決方法。
第二階段
庫爾特計數(shù)器的核心是感測小孔（見圖3，圓片A上的小孔），它這時得到了庫爾特兄弟最多的關(guān)注。對于許多潛在的應(yīng)用來說，要求小孔直徑小于100 lm，允許的尺寸和形狀容差都很小。樣品試管壁上直接做成的小孔可重復(fù)性低，這樣就促使對玻璃帶孔圓片（形成毛細管的橫截面）進行實驗。但是用來固定圓片的接合劑沒有成功（無效），且如果將下孔焊接在樣品試管上，熱量會使得小孔扭曲變形。還試用了用作表軸承的環(huán)寶石，Hermann Foery（瑞士珠寶公司，位于瑞士洛迦諾市）提供了實驗用的寶石，用其做成了早期低噪聲小孔。與Sam Gutilla（美國伊利諾斯州芝加哥市Del Mar Scientific公司）合作，開發(fā)出一種將寶石焊接到樣品試管上的方法。寶石上精確的柱狀小孔不受焊接的影響，并為電流的流動和樣品懸浮液提供了持久耐用的管道。
到1958年底，對焊接有環(huán)寶石的可互換樣品試管（見圖3中的B）的提出了專利申請。10 所選寶石的厚度可以提供小孔長度直徑比約為0.75，這樣可以盡量減少基本專利4和美國國立衛(wèi)生研究院研究9中提到的微粒重合現(xiàn)象。到了1958年，庫爾特兄弟已經(jīng)準(zhǔn)備好創(chuàng)立庫爾特電子公司，以及庫爾特銷售公司。母公司最早的兩名全職員工是長期提供義務(wù)服務(wù)的小約瑟夫 R.庫爾特和沃爾特•豪格（Walter Hogg）。庫爾特兄弟的父親最初只是周末到公司來做兼職的秘書和會計工作，但此時他已經(jīng)68歲了，他從鐵路報務(wù)員的崗位上退休，和他的兒子們一起工作，一直到1971年才部分退休。沃爾特是第一個在公司工作達20年之久的員工，指定其為發(fā)明人的美國專利比指定華萊士為發(fā)明人的美國專利還多一些（各為95項專利和82項專利），沃爾特也是公司內(nèi)唯一比華萊士擁有更多專利的員工。
事后看來，1958年是一個重要的起點。Kilby發(fā)明了振蕩器——第一個集成電路。很快地，Noyce和Hoerni開發(fā)出平面工藝，使得微電子迅猛發(fā)展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光學(xué)頻率上工作的要求，在兩年后，Maiman發(fā)現(xiàn)了激光。所有這些發(fā)展都為新公司的未來起到了舉足輕重的作用。
開始時由Ernie Yasaka組裝原型的復(fù)制品14，也就是現(xiàn)在所說的A型庫爾特計數(shù)器®，由華萊士進行銷售。為了可用于工業(yè)目的15 ，在樣品臺上添加了一個攪拌器（見圖4）。新公司立即需要關(guān)注的是一篇論文證實脈沖幅度和顆粒體積之間有正相關(guān)關(guān)系。通過將一個庫爾特計數(shù)器®和具有雙可變脈沖閾值的單通道脈沖－高度分析器（PHA）進行連接，Kubitschek獲得了第一個微分粒度分布；這樣就凸顯出A型計數(shù)器的兩個缺點：第一，它單一的閾值需要通過連續(xù)增加閾值進行多次樣品測試來獲得累積粒度分布14,16，而且需要大量的時間和計算來人工獲得微分粒度分布。很明顯，非常需要自動化方法進行粒度分析；第二個缺點是，用于提供小孔電流的電壓源使得脈沖幅度對于特定小孔的大小、特定懸浮介質(zhì)的電阻系數(shù)以及特定懸浮介質(zhì)中溫度引起的變化都很敏感14,15，這些都使精確計數(shù)和粒度分析變得復(fù)雜。
圖4 A型庫爾特計數(shù)器，帶工業(yè)用途樣品臺（圖3），右邊所示。樣品臺右上側(cè)的黑色圓形物體為攪拌器馬達，用于使工業(yè)用途粒子保持在懸浮液中；在血細胞計數(shù)時，樣品架上不會使用攪拌器�？刂婆_從左到右包括：機械計數(shù)器（用于慢速累計的高值數(shù)字），三個十進制計數(shù)器（用于快速累計的低值數(shù)字），以及示波鏡顯示管。單閥值和小孔電流的控制裝置在顯示管治下。
在白細胞計數(shù)上取得了良好的成果后17，公司在1960年引進了一種改進的儀器18 ，旨在進一步對細胞和顆粒大小進行精確的測量。使用電流源對小孔進行激勵代替了原來的電壓源，而用來感測顆粒脈沖的雙閾值電流靈敏放大器代替了原來的單閾值電壓放大器。因此，B型庫爾特計數(shù)器對限制A型計數(shù)器的那些因素不敏感，它的雙閾值聯(lián)鎖，形成了一種可移動的通道，由定序四秒計時器來控制。它附屬的H型分布繪圖儀20可以從100秒樣品運行中自動累計25個通道的微分粒度分布18。C型庫爾特計數(shù)器的開發(fā)也取得了進展——它的原型包括12通道的脈沖－高度分析器。它的350多個真空管可以給公司的設(shè)施供暖，它的體形巨大，搬運時需要拆開。到1961年，當(dāng)公司從芝加哥搬到佛羅里達州的Hialeah時，C型庫爾特計數(shù)器已經(jīng)小到可以放在桌面上了。
20世紀60年代，在紅細胞和白細胞7,18,22–28的計數(shù)和大小測量上，A型和B型計數(shù)器都證明很有用（見評論25,27），而且在微生物學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域粒度分析上也獲得了應(yīng)用31 。但同時，也產(chǎn)生了擔(dān)憂。1959年，按照庫爾特原則設(shè)計了一種商用型儀器。32 1960年，美國國立衛(wèi)生研究院研究中9所發(fā)現(xiàn)的非對稱分布得到了證實。笨重的稀釋器促使一位客戶自己設(shè)計更好用的儀器22。1962年，發(fā)現(xiàn)感測小孔的長度直徑比影響粒度分析的分辨率。34 一家公司（后來成為庫爾特兄弟公司的競爭對手）就庫爾特原則的一種衍生模式35申請了專利，而庫爾特銷售公司的一名主管自己也申請了一種衍生樣品管的專利36，他后來離開了庫爾特公司，也成為了庫爾特公司的競爭對手37。此外，早期的血小板計數(shù)實驗也遇到了沒有預(yù)想到的干擾，干擾顯然來自相位顯微鏡無法發(fā)現(xiàn)的小顆粒38。
Lushbaugh等人將100通道的PHA和A型庫爾特計數(shù)器39,40連接在一起，提高了測量的成本。很快，幾家公司都把為特定目的制作的庫爾特顆粒感測器和商用型PHA連接在一起，可以提供多達512個通道29。體積測量工具的可用性和復(fù)雜度越來越高，使得在測量各種細胞和顆粒的粒度分布上，使用人工工具越來越明顯1。華萊士這樣評論說，“面臨挑戰(zhàn)也很好，我們肯定能夠分享一部分好處�！�
第三階段
感測小孔（見圖3帶孔圓片上的小孔）是庫爾特原理的核心，設(shè)計一個庫爾特計數(shù)器，自動彌補其功能特點上的不足，現(xiàn)在成為首要任務(wù)。美國國立衛(wèi)生研究院的研究注意到，感測小孔的敏感量是幾何小孔的三倍，這是激勵電流流過樣品容器和樣品管中懸浮介質(zhì)所產(chǎn)生的電場的結(jié)果（見圖3）。量測系統(tǒng)產(chǎn)生的類似水動力場使得細胞（或粒子）通過感測小孔時，細胞（或顆粒）和電場產(chǎn)生相互作用。對于兩種小孔場來說，重要的顆粒相互作用是發(fā)生在包含感測小孔的敏感體積內(nèi)，而且從小孔入口和出口處成半橢圓形向外延伸到三到四倍小孔直徑的距離處。
因此，通過排出和細胞相同體積量的導(dǎo)電懸浮媒介，每個細胞在它的范圍內(nèi)扭曲了電場——特別是在通過感測小孔時。結(jié)果是，細胞的體積和小孔的相當(dāng)。小孔電阻的變化（通常是50,000分之一），以及通過小孔時帶來的電阻的細小變化，產(chǎn)生了信號脈沖，這樣就能夠進行細胞計數(shù)和測量大小。要達到精確的計數(shù)和可重復(fù)的大小量測，要求通過小孔的懸浮流非常平穩(wěn)。
和離子電流不同，由于懸浮介質(zhì)的聚集和黏性，懸浮液流受到感測小孔表面慣性和邊界層的影響。結(jié)果是，這些對小孔和它的兩個孔口產(chǎn)生微幾何學(xué)反應(yīng)50 ，在小孔軸心中點周圍產(chǎn)生不對稱的動力流場。在出口孔洞產(chǎn)生的環(huán)型流體將顆粒帶回小孔的感測體積內(nèi)，這樣會產(chǎn)生二次脈沖，導(dǎo)致錯誤的顆粒計數(shù)結(jié)果。例如，沃爾特•豪格在一次早期的血小板研究中發(fā)現(xiàn)38，所遇見的假微粒是那些重新進入感測體積內(nèi)的紅細胞，二次脈沖使它們重新被計作血小板。將顆粒從出口孔帶走的輔助流可以防止顆粒循環(huán)和二次脈沖。
一直認為同時通過小孔敏感體積的細胞通過屏蔽顆粒脈沖會減少細胞計數(shù)4,7，但計數(shù)上的損失可以通過懸浮液中細胞濃度從統(tǒng)計學(xué)角度預(yù)測出來9,52–60。因此，單通道計數(shù)可以通過合適的電路自動糾正61，最新一個版本的D型庫爾特計數(shù)器介紹了這一方法。然而，同時通過的顆粒產(chǎn)生的非典型脈沖還導(dǎo)致了粒度分布變寬45，典型紅細胞粒度分布出現(xiàn)不對稱39–41,44,62。在美國國立衛(wèi)生研究院的研究中9把這種不對稱歸為粒子重合，但很快在其它細胞類型38和粒子的粒度分布中也發(fā)現(xiàn)了這種不對稱31,63,64。在提高測定體積的準(zhǔn)確性后，紅細胞的粒度分布被證實呈雙峰性40,41,65。這些分布假象都造成尺寸測量的分辨率降低。
到20世紀60年代后期，與體積測定產(chǎn)生假象的原因有關(guān)的研究迅速發(fā)展28,30,44,45,49,65–78，幾個研究單位根據(jù)庫爾特原理建立起實驗系統(tǒng)。顆粒以離軸不同的徑向距離通過感測小孔時，會出現(xiàn)麻煩的粒度分布假象。在低有效顆粒濃度下，長度是直徑幾倍的小孔可以提高測量分辨率34,41,67,80，圍繞一個更小懸浮液流的輔助流可以水動力方式將通過小孔的顆粒集中在軸附近。在典型的顆粒濃度下，在小孔中心點對信號脈沖抽樣，或者按照持續(xù)時間對信號脈沖進行選擇，可以大大提高體積測定的精確度（見概覽65,67,78,86–88）。
對小孔功能特性進行研究的一個重要結(jié)果就是發(fā)明了第一個細胞分類器48,70,89–91，它可以判斷紅細胞雙峰分布是事實還是假象。Fulwyler將庫爾特原理和噴墨技術(shù)相結(jié)合，并使用該成果將細胞從單一的分布模式中挑選出來。當(dāng)挑選出來的紅細胞被重新測定大小后，結(jié)果表明原來的雙峰形式是一種假象。
在這次研究大發(fā)展中，庫爾特計數(shù)器的型號隨著電子學(xué)的發(fā)展而發(fā)展，裝有晶體管的F型和C型同時替代了A型。樣品臺進行了改裝，J型分布繪圖儀代替了H型分布繪圖儀。1968年下半年，出現(xiàn)了第一個自動化的血液分析計94——7個參數(shù)的S型庫爾特計數(shù)器®。同時，裝有晶體管的T型庫爾特計數(shù)器®代替了C型庫爾特計數(shù)器®，用于工業(yè)目的。在集成電路的基礎(chǔ)上，1970年推出了Z系列計數(shù)器。1972年出現(xiàn)了Channelyzer®體積分析儀，同時還出現(xiàn)了工業(yè)用TA系列分析儀，它包含了計數(shù)器和16通道PHA電路。隨后不久，這些儀器都開始采用微處理器。
華萊士經(jīng)常評論說1，“只要它是有用的，人們就會購買。”隨著產(chǎn)品的不斷改進，銷售量也越來越大。
2000年以后出品的Multisizer系列在工業(yè)、生物等各領(lǐng)域具有不可替代的地位，源自于該型號具備極高的分辨率，并可依據(jù)其最新開發(fā)的DPP處理器，單獨分析個體顆粒的脈沖信號，使得對測量全過程顆粒或細胞的體積或粒徑的變化的監(jiān)控成為可能。該脈沖處理器的技術(shù)的誕生也使得粒度分析儀領(lǐng)域添加了一項獨一無二的過程監(jiān)控功能（圖五）。
概要
開始是個不能獲得專利的小孔，卻促成了一個原理的發(fā)現(xiàn)，且獲得了專利。庫爾特原理的發(fā)現(xiàn)來自華萊士將辛苦的例行工作變?yōu)樽詣踊僮鞯脑竿�，庫爾特原理提供了一種可重復(fù)的對細胞或顆粒體積（恰當(dāng)校準(zhǔn)時）進行物理測量的方法，此原理還促進發(fā)明了一系列越來越復(fù)雜的自動化工具。使用庫爾特原理的儀器被廣泛接受，這使得其它一些公司也紛紛開發(fā)出類似的工具。庫爾特原理仍然是測量顯微顆粒體積的方法之一，已經(jīng)在許多科學(xué)領(lǐng)域被包括在各類標(biāo)準(zhǔn)中。到20世紀80年代后期，僅美國就有5萬多種庫爾特計數(shù)器在使用。描述其實際應(yīng)用和理論設(shè)計的刊物現(xiàn)在數(shù)以千計，相關(guān)的專利也有好幾百種。
在華萊士的基本專利中，4 他通過兩種形式的感測小孔（都是使用介電材料）定義了他的原理。他更喜歡軸向激勵/感測這種形式，因為它更容易生產(chǎn)，且產(chǎn)生的是線性體積反應(yīng)。有趣的是，由于在導(dǎo)電材料上形成的電偶層暴露在離子介質(zhì)中的電場內(nèi)，即便是小孔是在導(dǎo)電材料中形成的110,111，上述形式也可以奏效。所產(chǎn)生的信號脈沖除了能反映顆粒的體積，也能反映顆粒的電氣化學(xué)性質(zhì)、包含感測小孔的材料以及懸浮介質(zhì)。如果感測小孔是以混合結(jié)構(gòu)材料中制成，包括兩種傳導(dǎo)材料中華萊士原有孔洞，這種軸向形式也同樣奏效。由于顆粒要么在小孔出口再循環(huán)，要么遠離軸而通過孔洞，因此所獲粒度分布產(chǎn)生的假象最少。
庫爾特原理的軸向?qū)嵤┠Ｊ狡褚呀?jīng)獲得了廣泛的關(guān)注，但是由于熱噪聲的原因，使得將其尺寸縮小的努力遇到了瓶頸。原則上來說，第二種形式采用橫穿懸浮流的激勵和感測，這樣可以感測到更小的顆粒，但代價是要求體積線性化（基于選定形狀的小孔和電極）。35,113–115
庫爾特原理第四階段的發(fā)展是包括以上所說的這些，還是將新出現(xiàn)的科學(xué)技術(shù)和已有的技術(shù)相結(jié)合，我們拭目以待。
后記
當(dāng)庫爾特在努力領(lǐng)悟怎樣發(fā)現(xiàn)庫爾特原理時，他的父親為兄弟倆寫了這樣一首詩：
為什么不去導(dǎo)引它，它在你的掌握之中，你能哺育和引導(dǎo)它，你能達到你的目標(biāo)！充分利用這一天分，讓它朝好的方向努力。你的思想就是你的生命；天才利用它——你也一樣！
這出分為三幕的戲劇（本文的三個階段）表明他和約瑟夫都很好地領(lǐng)會了父親的建議。華萊士看不到問題，但他能發(fā)現(xiàn)很多機會。他的發(fā)明洞察力在科學(xué)界得到廣泛的認同。約瑟夫能發(fā)現(xiàn)問題但是他把這些問題看作是挑戰(zhàn)。他在技術(shù)和商業(yè)領(lǐng)域都是一個執(zhí)行者。兄弟倆都相信科學(xué)應(yīng)該服務(wù)于人，他們倆互補，成功地為當(dāng)今科學(xué)設(shè)備的發(fā)展作出了貢獻。他們的努力所產(chǎn)生的人文價值勿庸置疑。
盡管他們?nèi)〉昧嗽S多成就，庫爾特兄弟（見圖6）仍然保持謙虛，并對革新性的思想保持熱情。他們對家庭十分投入，這也包括他們的雇員和朋友。兩人將自己的時間、經(jīng)驗和知識都無私地與他人分享。兩人都十分自立，但在一個難以達到的目標(biāo)上又相互支持幫助。當(dāng)他們付出的某次愿望良好的努力難以達到預(yù)期目標(biāo)，而且代價昂貴時，華萊士解釋說，“不嘗試的人是不會犯錯誤的”，而約瑟夫補充說，“有些東西是比金錢更重要的。”
一個人能有一位良師是幸運的。而那些有幸和庫爾特兄弟一起工作的人擁有了兩位良師。這篇簡短的回顧文章是為了紀念杰出的兄弟倆，他們總是喜歡努力做得更好，也鼓勵自己做得更好。(編輯整理：陳衛(wèi))
