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外泌體被發(fā)現(xiàn)至今已有近40年歷史，在疾病診斷、治療和藥物遞送中具有非常高的應(yīng)用潛力。外泌體的功能研究也是目前的研究熱點(diǎn)，其中涉及最關(guān)鍵的技術(shù)就是外泌體的表征。目前研究中常用的外泌體的表征方法有如下7種，其中流式細(xì)胞術(shù)能夠同時(shí)提供粒徑、濃度、蛋白分型等多維度表征，進(jìn)行定性和定量的分析。

但是流式細(xì)胞術(shù)怎樣表征外泌體呢？

今天我們分享由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所黃辰教授團(tuán)隊(duì)曹麗等博士發(fā)表的文章《基于CytoFLEX 流式細(xì)胞儀的外泌體表征方法》，幫助大家快速掌握流式細(xì)胞術(shù)直接表征外泌體的新方法。

Part.1

外泌體分離

1.1血清外泌體的分離

通過(guò)超高速離心法和試劑盒提取兩種方法提取血清來(lái)源外泌體?；诔匐x心法，將血清以 800 ×g離心5 min，2,000 ×g離心10 min，上清用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾。然后，將1-6 mL 血漿與等體積的冷PBS溶液混合，4℃，100,000×g離心2 h，沉淀用PBS重懸?；谠噭┖刑崛?，將 0.5 mL 血清與0.5 mL 的DBS-2溶液混合，4℃，1,500×g 離心20 min，上清與 252 μL ExoQuick 外泌體提取試劑混合，4℃ 孵育1 h后1,500 ×g 離心30 min，沉淀以PBS重懸，分裝后儲(chǔ)存在- 80℃保存。

1.2腫瘤外泌體的分離 

細(xì)胞上清腫瘤外泌體的提取主要基于超高速離心方法，如前所述將細(xì)胞上清液800 ×g 離心5 min，2,000 ×g 離心10 min以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后，將其轉(zhuǎn)移到超離管中在 4℃，100,000 ×g離心2h收集沉淀。繼續(xù)用PBS緩沖液重懸，在相同條件下重復(fù)離心獲得外泌體沉淀。提取的外泌體分裝后儲(chǔ)存在-80℃，避免反復(fù)凍融。

Part.2

外泌體的常規(guī)表征

2.1 納米粒子追蹤分析

將外泌體懸液稀釋于1x107 / mL 和1x109 / mL 之間，使用 Flow Nano Analyzer進(jìn)行外泌體的納米粒子跟蹤分析，儀器通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化顆粒進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.2 透射電子顯微鏡 (TEM） 

將3 μL外泌體溶液等分試樣置于銅涂層上，并在2% 磷鎢酸中負(fù)染色10 min。在白熾燈下干燥2 min后，使用透射電子顯微鏡進(jìn)行取圖。

2.3 Western blot 

按照 BCA 試劑盒的說(shuō)明，在96 孔板中加入20 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，然后每孔加入200 μL 工作液，37℃孵育30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。然后，將20 μg 外泌體蛋白在5 x SDS 緩沖液中變性后，并在10% SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分離，恒流轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上， 后用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，小鼠單克隆抗體 CD63、小鼠單克隆抗體 TSG101、小鼠單克隆抗體 CD81和兔多克隆抗體CD171抗體（1:1000稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜孵育，通過(guò)TBST充分漂洗后使用同源二抗（1:5000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?1h，漂洗后通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀顯色。

2.4 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀的粒徑分析 

取外泌體溶液（5-10μL）用PBS磷酸鹽平衡溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)＿M(jìn)行10倍、100倍和1000倍稀釋?zhuān)罄肅ytoFLEX流式細(xì)胞儀初步用于檢測(cè)EV顆粒的數(shù)量以選擇最合適的稀釋濃度（平均流速小于10,000個(gè)/s）。在合適稀釋倍數(shù)下，以相同顆粒數(shù)或相同體積數(shù)為終止條件進(jìn)行外泌體測(cè)定。

2.5 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀的分子表征 

選定合適稀釋倍數(shù)后，加入1 μg PE- CD81抗體、 APC-CD63或PE- CD171抗體后樣本進(jìn)行充分混勻，室溫避光孵育 15 min后使用 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分子表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Part.1

外泌體的常規(guī)表征

對(duì)相同來(lái)源血液樣本分別采用試劑盒法和超高速離心法進(jìn)行外泌體分離，并利用透射電鏡、粒徑檢測(cè)和蛋白質(zhì)印跡鑒定進(jìn)行外泌體的常規(guī)表征，表征結(jié)果如圖 1 所示。

圖 1 血液來(lái)源外泌體的常規(guī)表征

A. 外泌體的納米粒子追蹤分析。B. 基于試劑盒法和超高速離心法在透射電子顯微鏡下的外泌體圖像。C. Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81 和 TSG101的表達(dá)。

Part.2

流式細(xì)胞術(shù)鑒定粒徑和外泌體標(biāo)志物

首先，基于已知粒徑大小的標(biāo)準(zhǔn)化微球?qū)崿F(xiàn)儀器的校正，并有效圈定粒徑區(qū)域（圖2A）。然后，梯度稀釋后的樣本經(jīng)流式測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰的顯示了樣品的粒度分布，發(fā)現(xiàn)絕大部分顆粒尺寸小于150nm，小部分顆粒聚集在150-300nm之間，這與規(guī)定的外泌體大小相符（圖 2B）。為進(jìn)一步了鑒定樣品的微囊泡結(jié)構(gòu)，我們向樣本中加入Triton X-100以破壞囊泡結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明加入Triton X-100的樣本顆粒大小發(fā)生明顯變化（圖2C）。此外，通過(guò)向稀釋后樣本加入PE-CD81或APC-CD63，從而直接通過(guò)CytoFLEX 流式檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣本中CD81的表征率為69.79%，CD63表征的顆粒占70.55%（圖2D）。

圖 2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定粒徑和外泌體表面標(biāo)志蛋白

A. 標(biāo)準(zhǔn)化微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。B. 外泌體樣品粒徑分布情況。C. 加入 Triton X-100 后粒徑分布情況。D. PE-CD81或APC-CD63標(biāo)記外泌體的表征率分析。

Part.3

流式細(xì)胞儀定量表征外泌體蛋白

由于外泌體缺少內(nèi)參蛋白，對(duì)外泌體相關(guān)分子的定量分析一直存在爭(zhēng)議，而CytoFLEX 流式基于相同體積或固定數(shù)量的方法將為外泌體相關(guān)蛋白的研究提供更為直接的分析方法。我們利用CytoFLEX 流式細(xì)胞儀以相同顆粒數(shù)為結(jié)束條件進(jìn)行CD63、CD81和 CD171的表征情況檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表征率分別為為70.12%、65.47%和 22.74%（圖3）。

圖 3 流式細(xì)胞儀定量表征外泌體蛋白

Part.4

流式鑒定分離方法對(duì)外泌體標(biāo)記率的影響

對(duì)于同一血清樣本，我們分別使用超高速離心法和試劑盒法分別進(jìn)行提取，后經(jīng)流式檢測(cè)兩種方法獲取的外泌體的粒徑分布以及標(biāo)志物表征情況。通過(guò)比較粒徑大小發(fā)現(xiàn)，基于試劑盒法分離的血清來(lái)源外泌體的粒徑明顯高于基于超速離心的方法分離的外泌體粒徑，同時(shí)發(fā)現(xiàn)基于試劑盒方法提取的外泌體聚集到的更多的大尺寸顆粒，150 nm處占比6.38%（圖4A）。將所有樣本與PE-CD81或APC-CD63混合孵育后，發(fā)現(xiàn)兩種方法分離的外泌體均檢測(cè)到CD81和CD63的表達(dá)，平均表征率大于50%。

圖 4 流式鑒定分離方法的外泌體粒徑和標(biāo)志蛋白表征率

Part.5

聯(lián)合標(biāo)記在外泌體檢測(cè)中的探究

在成功實(shí)現(xiàn)PE-CD81或APC-CD63單獨(dú)標(biāo)記檢測(cè)外泌體的基礎(chǔ)上，我們積極探索外泌體的聯(lián)合標(biāo)記。我們對(duì)采用不同提取方法的血清來(lái)源外泌體進(jìn)行聯(lián)合標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果表明試劑盒法提取的外泌體CD81+CD63 聯(lián)合標(biāo)記的表征率為 81.60%，而超高速離心提取的外泌體表征率為 15.39%，同時(shí)試劑盒提取樣本聚集到更高粒徑的顆粒（圖 5）。這一研究表明CytoFLEX 流式可以用于多種分子的聯(lián)合檢測(cè)，而這將為外泌體相關(guān)分子的聯(lián)合檢測(cè)提供更多的可能。

圖 5 CD81和CD63聯(lián)合標(biāo)記表征外泌體

總結(jié)

這篇文章選擇經(jīng)透射電鏡、納米顆粒追蹤、Western blot方法進(jìn)行常規(guī)表征后的外泌體，按照10倍、100倍和1000倍梯度稀釋后依托CytoFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，并研究不同分離方法、不同超離次數(shù)對(duì)外泌體特性的影響，同時(shí)進(jìn)一步探究聯(lián)合標(biāo)記在在外泌體表征的應(yīng)用可能性。

該方法可以用于分析樣本的粒徑大小分布情況、標(biāo)志物蛋白表征情況以及外泌體相關(guān)分子的表達(dá)，這將極大豐富外泌體表征工作。并且基于CytoFLEX 流式分析僅需5-10 μL外泌體懸浮液，一系列操作也可在1-2 h內(nèi)完成，這將大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本和提高實(shí)驗(yàn)速度。

 ● 參考文獻(xiàn)： 

[1]曹麗等. "基于CytoFLEX流式細(xì)胞儀的外泌體表征方法." 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療 29.3(2023):39-46.