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聲學(xué)微滴噴射（AED）技術(shù)使用聚焦的聲能實現(xiàn)高精度和準(zhǔn)確度轉(zhuǎn)移納升級液滴。Echo這種非接觸式、無需吸頭、低體積加液技術(shù)將交叉污染的可能性降至最低，同時極大程度降低試劑和耗材的成本。迄今為止，Echo除了廣泛應(yīng)用于高通量化合物篩選之外，還有另一個強(qiáng)大的技術(shù)應(yīng)用方向——快速發(fā)展的合成生物學(xué)領(lǐng)域，如DNA合成和連接，Echo聲波移液使得PCR以及Golden Gate 和 Gibson兩種一步法DNA連接方法成功地縮小至納升級規(guī)模，極大地提高DNA合成和連接效率并有效將試劑成本降低20至100倍。大部分DNA組裝的費(fèi)用成本是酶，包括DNA聚合酶，因此，將反應(yīng)體積從微升縮小到納升級，同時保持高裝配效率，將使合成生物學(xué)家更容易完成DNA合成和組裝。這也使Echo聲波移液成為DNA生物鑄造廠時代的合成生物學(xué)中的一項工具性技術(shù)。比如在常規(guī)終點(diǎn)法PCR實驗中，Echo可將PCR反應(yīng)體系降低至250nL，成功擴(kuò)增出1.3kb的片段。

圖1 通過 Echo進(jìn)行PCR體系構(gòu)建。

Gibson DNA連接方法是合成生物學(xué)中使用最多的技術(shù)，它可以組裝從DNA序列至小基因組重疊DNA片段大小，優(yōu)點(diǎn)是它與序列無關(guān)并生成無痕DNA連接產(chǎn)物。Golden Gate DNA連接方法利用TypeIIS限制性內(nèi)切酶和連接酶組合來組裝DNA片段。正如我們先前所介紹的一樣，使用Echo聲波移液，能夠?qū)崿F(xiàn)這兩種一步式DNA連接反應(yīng)的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反應(yīng)體積下實現(xiàn)Gibson的正確組裝，效率可與手工實驗相媲美或優(yōu)于20 μL反應(yīng)，這使試劑成本降低20倍以上；Golden Gate可實現(xiàn)50 nL 、250 nL和500 nL規(guī)模反應(yīng)體積的DNA（手工實驗時通常為 15 μL反應(yīng)）成功組裝，效率同樣高于手工實驗對照，使試劑用量至少降低30倍。

生物合成途徑的闡明和重構(gòu)以及調(diào)控回路和網(wǎng)絡(luò)的工程設(shè)計，都需要蛋白質(zhì)功能的知識。植物一直被用作生物活性和高價值天然產(chǎn)物的來源，但由于植物之中大型基因家族的普遍存在，使得將特定功能與單個蛋白質(zhì)聯(lián)系起來具有挑戰(zhàn)性，同時也面臨需要付出大量努力來優(yōu)化表達(dá)和純化方案進(jìn)行蛋白質(zhì)表征這一技術(shù)瓶頸。Biofoundry的獨(dú)特優(yōu)勢能夠加速“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”周期的能力，可加速優(yōu)化并實現(xiàn)酶活性的快速篩選；無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）結(jié)合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和過量輔因子，以及含有翻譯機(jī)制的粗裂解物，是一種成熟的體外快速蛋白質(zhì)生產(chǎn)工具，顯著優(yōu)勢是能夠直接進(jìn)行功能分析，而無需耗時的細(xì)胞破碎和純化方案，同時還適用于自動化和小型化，減少操作錯誤和CFPS反應(yīng)中的可變性，促進(jìn)主動學(xué)習(xí)引導(dǎo)的反應(yīng)條件優(yōu)化，并普遍增加實驗的通量，最大限度地減少DBTL循環(huán)中的“構(gòu)建”時間。SynTrack是一個基于web的工作流程驅(qū)動的bioCAM平臺，用于管理和跟蹤DNA制造過程。SynTrack導(dǎo)入boost指定的構(gòu)建過程信息，其中包括操作人員（利用機(jī)器人平臺）執(zhí)行所有“構(gòu)建”操作的分步說明。SynTrack可以為液體處理機(jī)器人（如Biomek FX和Echo平臺）生成移液指令，自動將接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通過Echo自動化平臺構(gòu)建2μL反應(yīng)體積（手動為20μL）進(jìn)行一步法Golden Gate DNA組裝反應(yīng)，隨后構(gòu)建2μL CFPS反應(yīng)體系進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過熒光素酶（該標(biāo)簽可輕松去除）快速定量蛋白表達(dá)水平，隨后無需蛋白純化即可使用游離蛋白質(zhì)合成反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行多種功能表征。

圖2 Biofoundry輔助DNA組裝和植物蛋白游離蛋白合成（CFPS）的工作流程。編碼目的蛋白的0級DNA部分（模塊）可以組裝成用于CFPS或在植物中表達(dá)的功能表達(dá)質(zhì)粒。使用Echo篩選蛋白質(zhì)變體的文庫，使用 HiBiTLgBiT熒光素酶發(fā)光實驗定量確定最佳表達(dá)構(gòu)型。

使用Echo聲波移液配合無細(xì)胞蛋白合成（CFPS）技術(shù)也可在96和384孔板中進(jìn)行代謝工程檢測，通過Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，實現(xiàn)如C4-C6酸和醇生化產(chǎn)物的負(fù)碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大應(yīng)用潛能。正是由于模式生物大腸桿菌無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯（TXTL）在DNA定向體外蛋白質(zhì)合成的應(yīng)用范圍越來越大，一些實驗室也開發(fā)了全大腸桿菌TXTL工具箱，并通過Echo實現(xiàn)了流程自動化。另一個無細(xì)胞合成生物應(yīng)用方向是非模式生物體外原型設(shè)計和快速表征代謝途徑，加速體內(nèi)生物合成途徑測試，使例如梭狀芽胞桿菌等非模式生物能夠利用可再生資源（木質(zhì)纖維素生物質(zhì)或CO和H2合成氣）生產(chǎn)更多高價值產(chǎn)品。使用DNA組裝設(shè)計自動化軟件J5進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計和生成實驗運(yùn)行worklist，發(fā)送至Echo自動化平臺以2 μL體積進(jìn)行Golden Gate DNA組裝，可同時進(jìn)行多達(dá)6個部分（三個獨(dú)特啟動子和終止子序列的開放閱讀框）的組裝，效率高達(dá)90%；這一質(zhì)粒系統(tǒng)將為非模式生物提供體外和體內(nèi)生物合成途徑的簡單測試框架，從而縮短開發(fā)周期。非模式生物巨雙歧桿菌的天然無細(xì)胞（NCF）轉(zhuǎn)錄翻譯平臺的快速建立也借助了Echo，并和貝葉斯模型參數(shù)推斷方法相結(jié)合，可以在數(shù)小時內(nèi)對基因表達(dá)工具進(jìn)行嚴(yán)格的表征，并且這個平臺還有望擴(kuò)展到一系列其他重要的底盤微生物的合成生物學(xué)應(yīng)用。

圖3 使用兼容的無細(xì)胞載體系統(tǒng)組裝三基因構(gòu)建體的Golden Gate。（a）Golden Gate組裝工作流程的示意圖，包括自動化組裝，包括質(zhì)粒的計算設(shè)計、Echo自動化液體處理操作指令、質(zhì)粒組裝和質(zhì)粒確認(rèn)。（b）含有構(gòu)建的梭狀芽孢桿菌表達(dá)載體的六個克隆中的質(zhì)粒組裝的PCR鑒定。

圖4 非模型微生物的無細(xì)胞原型設(shè)計。（A）在NCF中使用內(nèi)源性能量再生和轉(zhuǎn)錄-翻譯組分測試合成的基因表達(dá)質(zhì)粒。（B）在B. megaterium NCF中使用MGapt（mRNA）適配體和GFP進(jìn)行平行轉(zhuǎn)錄-翻譯測定。（C）借助Echo液體處理工作站，用于快速篩選無細(xì)胞反應(yīng)的半自動化工作流程。

微生物系統(tǒng)中異源生產(chǎn)的特定高價值化學(xué)物質(zhì)大多需要資源密集型分析過程（如HPLC和MS）進(jìn)行定量，較低的分析通量使DBTL循環(huán)遇到了一定的瓶頸。而生物傳感器通常與基因表達(dá)系統(tǒng)耦合，為此人們越來越關(guān)注開發(fā)熒光生物傳感器用于合成生物學(xué)中，來檢測小分子和物理信號。通過為Echo編寫Python移液腳本，構(gòu)建384或1536孔板的10μL或2μL熒光酶標(biāo)檢測體系，基于大腸桿菌雙鍵還原酶（EcCurA）非特異性結(jié)合后熒光極大增強(qiáng)的特性，開發(fā)了一種熒光復(fù)合物直接蛋白質(zhì)（DiPro）生物傳感器，作為微生物異源姜黃素酶促合成的檢測單元，且不需要任何額外的基因表達(dá)后步驟或特定的蛋白質(zhì)成熟要求。同樣，使用Echo進(jìn)行小反應(yīng)體系的熒光素酶化學(xué)發(fā)光體系構(gòu)建，高通量篩選分析脯氨酰寡肽酶異源表達(dá)變異株，將金屬響應(yīng)開關(guān)整合到蛋白質(zhì)中，也為精確調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了新的機(jī)會。

圖5 Ni(II)依賴的開關(guān)

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，使得通過大腸桿菌或釀酒酵母等微生物用于篩選氫化烯烴的酶，成為克服石油精煉過程中烯烴加氫面臨的催化劑中毒、傳質(zhì)限制、發(fā)熱以及與氫氣、儲存和催化劑等相關(guān)的一個重要的解決方案。相比于LC/GC-MS復(fù)雜的工作流程和較長的分析時間，使用Echo聲波移液和薄層色譜搭建的自動化96孔篩選平臺極大地提高了檢測速度，使并行多個樣品檢測即時可視化，讀值結(jié)果更可靠，成為一種高效的篩選流程，用于確定與工程化GGR蛋白文庫相關(guān)的酶活性和產(chǎn)物形成譜。使用Echo將環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)物“打印”涂覆在薄層二氧化硅上，根據(jù)環(huán)氧化程度進(jìn)行色譜分離，并與發(fā)色團(tuán)共價連接，從而可以檢測具有獨(dú)特產(chǎn)物分布或增強(qiáng)還原酶活性的酶變體。經(jīng)過GC-MS驗證，這種基于薄層色譜的篩選可以區(qū)分選定突變體酶活性的四倍差異。

圖6 靶向SaGGR（源自嗜酸熱硫化葉菌的香葉基香葉基還原酶）中L377X（377位亮氨酸）的密碼子飽和誘變文庫高通量篩選方案

圖7 Echo聲波噴射液滴的優(yōu)化和時程分析中的應(yīng)用。a，通過Echo轉(zhuǎn)移到二氧化硅-TLC板上的考馬斯染色劑。確定50 nL為同時進(jìn)行48孔TLC分析的最佳體積。b, 30 μM WT SaGGR與2 mM法尼醇一起孵育的時程測定，每分鐘用環(huán)氧化試劑淬滅，并在單獨(dú)的泳道中點(diǎn)樣。隨著測定演化到其 48 分鐘的終點(diǎn)，對應(yīng)于H環(huán)氧化物衍生物的條帶H0-, H2-和H4-FOH用Rf(1)、Rf(2)和 Rf(3)表示，并分別增加強(qiáng)度，而副產(chǎn)物帶 Rf(s2)和Rf(S3)隨時間保持相對恒定。c, 從b中描述的時間過程得出的氣相色譜圖描述了法呢醇（H0）、di-(H2)和四氫法尼醇(H4)

Echo高通量DNA組裝還被用于在釀酒酵母固氮基因組合文庫中篩選功能性固氮酶異源表達(dá)基因，為固氮谷物開發(fā)并改變?nèi)蜣r(nóng)業(yè)系統(tǒng)提供極大支撐。DNA組裝和Echo自動化液體處理結(jié)合技術(shù)也入選了高校合成基因組暑期課程，這一培訓(xùn)課程旨在向研究人員傳授合成生物學(xué)和合成基因組科學(xué)最新進(jìn)展背后的理論和實踐技能，通過軟件研討會、課程和該領(lǐng)域領(lǐng)先成員的研究講座，與會者能夠在了解相關(guān)原理和技術(shù)的同時，在基于實驗室的實踐課程中直接使用合成生物學(xué)平臺開發(fā)的軟件和載體進(jìn)行驗證。在課程具體實踐中，Echo自動化DNA組裝技術(shù)大大提高了用于設(shè)計β-胡蘿卜素異源通路文庫的表達(dá)檢測的通量。同時，使用該平臺進(jìn)行的番茄紅素代謝途徑的自動化設(shè)計和構(gòu)建成果也于2020年發(fā)表。

圖8 帝國理工學(xué)院暑期合成基因組培訓(xùn)課程。（a）實驗室實踐，（b）自動DNA組裝編程，（c）合成基因組軟件工具研討會和（d）SCRaMbLE教程。

通過以上案例我們可以發(fā)現(xiàn)，Echo聲波移液在DBTL循環(huán)中起到承上啟下的串聯(lián)角色，既可接受“設(shè)計”流程中基于集成運(yùn)算生成的腳本指令完成DNA組裝，撐起“構(gòu)建”階段一眾重要的應(yīng)用方向；又可在“測試”過程中實現(xiàn)高通量自動化以及小體系精準(zhǔn)檢測，并傳遞數(shù)據(jù)為“學(xué)習(xí)”階段提供支撐，因而是合成生物學(xué)和Biofoundry不可或缺的好幫手。

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