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前言

Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀最少僅需170uL樣品體積即可得到細胞密度和活率結果。為了準確分析不同細胞，Vi-CELL BLU提供了創(chuàng)建和優(yōu)化自定義Cell Type設置的功能。本文我們拿容易團聚的HEK293細胞給大家介紹下Cell Type的設置是如何影響樣品的處理和圖像分析。

在分析團聚細胞時，Cell Type設置中首先會使用到的參數(shù)是Decluster degree，我們可以設置為None，Low，Medium或High，并且使用更靠后的值會增加軟件對團聚細胞的識別能力。

當出現(xiàn)過多的團聚，我們還需要考慮增加對樣品的Aspiration和Mixing Cycles次數(shù)。在每次Aspiration過程中，細胞樣品會在樣品管和注射器之間來回吹打混懸。對于那些很難混懸分散或傾向于粘到樣品杯壁上的細胞樣品，建議使用這種方法。在Mixing Cycle過程中，臺盼藍和細胞樣品一起在樣品管和注射器之間來回混勻。增加Mixing Cycles次數(shù)會讓臺盼藍混勻地更好。Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀的設計降低了剪切力對細胞的傷害。另外，低剪切力可以提高結果的重現(xiàn)性。但增加Aspiration或Mixing Cycles會提高額外剪切力，從而對比較脆弱的細胞產(chǎn)生潛在的危害。但是，對于團聚細胞系，這些額外的剪切力則可以用于破壞細胞的團聚。

Decluster degree和Aspiration/Mixing Cycles之間重要的區(qū)別在于它們是在哪個時刻影響的分析結果。Decluster degree只對測試結束后保存在軟件上的細胞照片根據(jù)不同設置的Decuster degree重新進行分析。而Aspiration和Mixing Cycles是在拍照前對細胞樣品就產(chǎn)生了影響，測試結束后無法再修改Aspiration和Mixing Cycles數(shù)值，得到再分析的結果。

因此，優(yōu)化Cell Type對于得到好的結果很重要，本文中對于團聚細胞分析，如何調(diào)整Cell Type提供了一些指導。

團聚的細胞懸液也是細胞培養(yǎng)條件欠佳的指標，包括但不限于過度消化、環(huán)境應激、過度生長和污染。細胞團聚限制了細胞對資源和可用增殖空間的獲取。這將阻礙細胞生長，降低通量，并影響下游分析結果，譬如像流式細胞儀分析方法需要單細胞溶液。此外，ISO 20391-1(4)中聲明，為了獲得最佳計數(shù)結果（與所使用的分析方法無關），需要單細胞懸浮液，并且需要正確的樣品制備流程。Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀用紅色框標記（非常）大的細胞團。由于對大細胞團進行計數(shù)容易出錯，因此這些大細胞團不會進行去團聚處理，并會自動從計數(shù)中排除。這些大細胞團的數(shù)量可以在結果文件的“Cluster Count”中找到，這是培養(yǎng)物中細胞團聚的良好指標。如果觀察到細胞團較多時，建議進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件或進行樣品處理。

方法

這些實驗中使用的是FreeStyle 293-F 細胞（Thermo Fisher，Cat.編號：R79007）。將 HEK 懸浮細胞在含有FreeStyle 293（30 mL）表達培養(yǎng)基的 50 mL Falcon 管中培養(yǎng)，每 3-4 天傳代培養(yǎng)一次，接種細胞密度為 0.2x106 個細胞/mL。它們在 37°C、250 rpm 和 5% CO2 濃度下孵育。

使用培養(yǎng) 4 天的細胞樣品進行初始測量，在Normal模式下使用Mammalian Cell Type重復測量 5 次。然后結果被導出（每 10 張圖像照片保存一張）并離線重新分析。為了重新分析，基于默認的Mammalian Cell Type創(chuàng)建了另外兩個Cell Type，但將去團聚度設置為Low和High。為了研究不同去團聚度設置的有效性，比較了這三種Cell Type總細胞密度和活細胞密度以及活率的結果。

之后，開始用 HEK 293-F 細胞進行新鮮培養(yǎng)，并在第 0、1、2、3 和 6 天取樣。然后，測試了其他采樣參數(shù)，因為所有日期的樣品都用默認的Mammalian Cell Type，以及將Aspiration和Mixing Cycles增加到10次的Cell Type。在所有采樣日，將細胞培養(yǎng)液用 5 mL 移液器混合 2 次，然后將 5 mL 細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到 15 mL  Facon管中。接著，用 1000 μL 移液器將樣品再混合 3 次，再將 3 x 500 μL 細胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL XR 細胞計數(shù)和活率分析儀樣品管中，以及將 6 x 200 μL 細胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL BLU 96 孔板中。Vi-CELL XR 細胞計數(shù)和活率分析儀上的樣品，使用圖 1 所示的Cell Type分析；在Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀上，兩種Cell Type交替進行。然后，將 2 x 10 μL 細胞樣品與臺盼藍 1:1 混合并轉(zhuǎn)移到一次性血球計數(shù)板中手動計數(shù)。

圖1：Vi-CELL XR上的分析設置，選擇的設置類似于Vi-CELL BLU上的設置

然后，在Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀上運行的樣品以High Decluster degree重新分析，在 Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀上共生成4種不同的細胞計數(shù)結果，以與 Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀的結果和手動計數(shù)結果進行比較。

表1. Vi-CELL BLU分析HEK 293-F的Cell Type，Mammalian Cell Type作為其他3個Cell Types的模板。

結果

在三個Decluster degree下（Low，Normal和High）得到的平均總細胞密度和活細胞密度（分別為 TCD 和 VCD）和活率進行了比較（圖2）。更高的去團聚度使得TCD 和 VCD 值均明顯增加（R2 > 0.98）。然而，使用較低或較高的Decluster degree時，細胞活率卻并不顯著增加或減少。

圖2：Vi-CELL BLU使用不同Decluster degree設置分析HEK 293-F的結果。平均總細胞和活細胞密度顯示在左軸上，平均活率顯示在右軸上。誤差線表示標準差。

表 2 中的圖像顯示了Decluster degree如何影響樣品分析，從而影響細胞濃度結果。所選圖像是圖2中其中一個測量樣品的圖像（部分），并且很好地表示了細胞樣品的狀態(tài)。如前所述，HEK 293 F細胞傾向于形成團聚體，而這些團聚體中的細胞可能難以計數(shù)準確。當 Decluster degree 設置為 low 時，某些團聚將不再被解聚，并且標有藍色圓圈，表示Vi-CELL軟件錯誤地將它們識別為單個顆粒，因為其尺寸較大，根據(jù)所選Cell Type參數(shù)未歸為一個細胞。通過更高的去團聚度，可以分析更多這些團聚細胞，從而產(chǎn)生單個團聚標記為Normal Decluster degree，所有團聚細胞均在High declustering下進行分析。更高的Decluster degree設置會導致識別出額外的細胞，可能導致人為地提高細胞密度，因為單個細胞可能（幾乎）分裂成兩個或多個顆粒。這些顆粒是被忽略還是算作活細胞或死細胞取決于其他Cell Type參數(shù)，例如大小、圓度和亮度。因此，優(yōu)化Cell Type設置對于獲得準確的結果很重要。

表2. 不同Decluster degree設置的分析結果，隨著Declustering增加，更多的細胞團聚被分析，細胞團聚體中更多的細胞被識別。

請注意，Cluster count不受Decluster degree的影響。對于“Low”和“High”設置，每次測量平均計數(shù) 1.6 個Clusters。Cluster count指示在樣本中發(fā)現(xiàn)了多少個過大的細胞團聚體。這些Cluster用紅色框標記，并且無論Decluster degree如何，都完全排除在分析之外。因此，高的Cluster count是大細胞團聚體的良好指示，需要在培養(yǎng)處理或樣品制備方面進行額外優(yōu)化，以獲得準確的細胞計數(shù)結果。

最終，在優(yōu)化Cell Type設置時，Vi-CELL BLU 軟件還提供了增加Aspiration和Mixing cycles的可能性。增加Aspiration和Mixing的影響評估，是使用默認的Mammalian Cell Type，將其中的Aspiration和Mixing cycles都設為10，每天對 HEK 293-F 細胞樣品進行采樣，并一式三份測定細胞密度。之后，使用表1所述的High Decluster degree重新分析所有測量值。將結果與使用Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀及手動計數(shù)獲得的值進行比較（圖3）。

圖3: Vi-CELL BLU用4種不同Cell Types檢測的總細胞密度和活率（藍-灰色），Vi-CELL XR（紅色）和手動細胞計數(shù)（綠色）。誤差線表示標準差。

圖 3 顯示了 Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀、血球計數(shù)板、Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀（使用默認Mammalian Cell Type）測試6天得到的細胞密度和活率具有可比性。此外，Mixing增加和/或High declustering的Cell Type會導致更高的細胞密度。在第3天，測量的平均 TCD 介于 2.81 – 4.12 百萬個細胞/mL 之間，分別使用默認的 Mammalian 和 Mammalian A10M10  High decluster。因此，與默認設置相比，更改兩個參數(shù)后結果增加了 47%。

然而，在第6天存活率下降到~70%，而且手動計數(shù)的TCD明顯比自動細胞計數(shù)儀的TCD更高。表 3 中的圖像（通過顯微鏡顯示 Neubauer 分析室）為這種偏差提供了清晰地解釋，因為與第 3 天相比，第 6 天的細胞樣品中顯示有更多的細胞聚集體。這些細胞聚集體很難計數(shù)，在分析過程中將完全忽略大的團聚細胞。

表3: 第3和第6天HEK 293-F細胞計數(shù)顯微鏡下的照片。第6天可以看到更多的細胞團聚體，細胞活率降低。

專注于培養(yǎng)的前 3 天（圖 4）可以進一步研究不同的Cell Type設置如何影響計數(shù)結果。第 3 天血球計數(shù)板圖像（表 3）顯示，到目前為止，細胞主要以小聚集體或單細胞形式生長。仔細觀察Cluster count可以發(fā)現(xiàn)，Clusters的平均數(shù)量從第 1 天的 0.7 個增加到第 2 天的 3.7 個和第 3 天的 8.7 個。同時，更高的Mixing和Aspiration cycles的效果似乎有所增加，第 1 天的 TCD 增加了 4%，而第 2 天和第 3 天分別增加了 17% 和 25%。在Mammalian A10M10 High decluster設置下的結果一直是最高濃度。

圖4: HEK培養(yǎng)的前3天。在 Vi-CELL BLU 上以藍灰色以及 Vi-CELL XR（紅色）和手動計數(shù)（綠色）測定四種不同的細胞密度和活率。誤差線表示標準差。

總之，每日采樣結果進一步證明了正確Cell Type設置的重要性。僅改變?nèi)齻€參數(shù)就導致 TCD 增加 47%。測量團聚的HEK細胞時，調(diào)整Decluster degree和Mixing/Aspiration cycles可以得到更高的TCD。然而，第6天的數(shù)據(jù)（圖3）表明，應避免過度團聚的細胞樣品，因為與手動計數(shù)相比，所有Cell Type的結果都明顯較低。

討論

本文討論了使用 Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀優(yōu)化細胞計數(shù)結果的幾種選擇。除了優(yōu)化一般的培養(yǎng)處理 - 這將改善細胞健康、通量和產(chǎn)率 – 可以通過調(diào)整樣品處理和分析來改進。通過演示使用不同Cell Type設置的影響，可以清楚地看出針對所用細胞系和應用優(yōu)化這些設置對于獲得好的分析結果至關重要。

在處理傾向于形成聚集體的細胞系時，對Decluster degree、Aspiration cycles和Mixing cycles的擬議更改是優(yōu)化計數(shù)性能的良好起點。但是，當可能需要進一步優(yōu)化時，請隨時向貝克曼庫爾特生命科學的相關技術人員尋求支持。

 ● 參考資料： 

1. Cell Culture Problems: Cell Clumping – Causes, How to Unclump Cells & How to Avoid Cell Clumping. akadeum.com. [Online] Akadeum Life Sciences, February 2021. [Cited: 25 July 2023.] 

2. Cell Clumping Troubleshooting. Sigma Aldrich. [Online] Merck KGaA. [Cited: 25 July 2023.] 

3. Biomass and Aggregation Analysis of Human Embryonic Kidney 293 Suspension Cell Cultures by Particle Size Measurement. Yung-Shyeng Tsao, Russell G. G. Condon, Eugene J. Schaefer, David A. Lindsay, and Zhong Liu. s.l. : Biotechnology progress, 2000, Bd. 16(5). 809-814.

4. ISO 20391-1. Biotechnology — Cell counting — Part 1: General guidance on cell counting methods. s.l. : ISO/TC 276, Biotechnology, 2018-01. First edition. ISO 20391-1:2018(E). 5. Cluster Count Analysis and Sample Preparation Considerations for the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. Wu, Andrew. s.l. : Beckman Coulter Life Sciences, 2023. 2023-GBL-EN-101754.

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