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CytoFLEX nano如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡多色分型？

貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué) 2024-10-19 | 閱讀：727

在我們探索EV功能的時(shí)候，最基礎(chǔ)的3個(gè)參數(shù)就是EV樣品的濃度，粒徑和分型。

濃度：EV的濃度信息對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物（即疾病相關(guān)的分子標(biāo)志）以及診斷疾病都非常關(guān)鍵。同時(shí)，通過(guò)精準(zhǔn)地測(cè)量EV的濃度，研究人員能夠更好地追蹤病人的疾病進(jìn)展，并評(píng)估治療是否有效。

粒徑：通過(guò)EV粒徑檢測(cè)，可有效區(qū)分不同EV亞型，更深入地了解其起源或功能。EV粒徑檢測(cè)對(duì)于EV樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制同樣至關(guān)重要。

分型：研究人員還需對(duì)EV進(jìn)行表征并識(shí)別其蛋白表達(dá)。對(duì)EV進(jìn)行表征分析，有助于研究人員了解EV的生物學(xué)功能，破譯EV在細(xì)胞間攜帶的特定信息/信號(hào)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含物中的疾病特異性分子（DNA、RNA、microRNA等）。

“ 采用流式細(xì)胞術(shù)可以同步獲取這些重要參數(shù)，特別是可以通過(guò)測(cè)定EV中或膜表面的蛋白表達(dá)，檢測(cè)顆粒的物理和化學(xué)特性。隨著對(duì)EV研究的不斷深入，研究者們的關(guān)注點(diǎn)已經(jīng)從整體EV群體逐步轉(zhuǎn)向更為細(xì)致的EV亞群分析，這種轉(zhuǎn)變有助于更精確地揭示EV在生理和病理過(guò)程中的具體功能?！?/p>

我們以從健康供體中分離的PPP（去血小板血漿）EV分群為例。3mL全血在200xg下離心5分鐘。從頂部取出1mL血漿，并通過(guò)200nm注射器過(guò)濾。使用70nm尺寸排阻柱（SEC）純化PPP。篩選出的組分用于單色染色和多色染色進(jìn)行免疫分型。然后用以下抗體對(duì)選定的PPP組分進(jìn)行染色：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7和CD235a PE。在CytoFLEX納米流式細(xì)胞儀上采集樣本，并在CytExpert nano中進(jìn)行分析。

檢測(cè)EV樣本時(shí)，樣品清潔度至關(guān)重要，因此在檢測(cè)前需要確保儀器的背景噪聲足夠低。CytoFLEX nano自帶Baseline檢測(cè)功能，可以自動(dòng)檢查鞘液并基于滿足QC要求的預(yù)設(shè)閾值，自動(dòng)監(jiān)測(cè)并分析背景信號(hào)，快速評(píng)估儀器清潔度。在運(yùn)行實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，Baseline檢測(cè)功能也可以即時(shí)檢查儀器和緩沖液清潔度，保證樣品間攜帶污染率小于1%。

在上樣前，選擇合適的樣品濃度至關(guān)重要，以避免出現(xiàn)swarm現(xiàn)象。我們通過(guò)EPS（<6000 eps）、100%事件處理和避免粘連體，MdFI等維度，選擇適合的樣品稀釋比例。

在獲取檢測(cè)數(shù)據(jù)后，我們按照以下設(shè)門策略進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：

1.Gate on Singlets

2.Gate out CD235+ (possible aggregates)

3. From CD235-, identify CD61+ (Platelet-originated EVs) and CD61-

4. Further identify CD9+ and CD9- The last plots help to identify CD81+ and CD63+ from these subpopulation

CytoFLEX nano 納米流式分析儀使研究人員能夠清晰檢測(cè)血漿來(lái)源的EV。該分析儀可準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分單個(gè)PPP EV顆粒（包括PB、FITC、PE、APC和PC7）上的多個(gè)熒光通道中的信號(hào)，便于用戶監(jiān)測(cè)低表達(dá)的稀有陽(yáng)性亞群（如CD63和標(biāo)記紅細(xì)胞污染的CD235a）。