国产在线 | 日韩,疯狂做受xxxx高潮不断,影音先锋女人aa鲁色资源,欧美丰满熟妇xxxx性大屁股

基因治療是生物制藥行業(yè)中一個(gè)快速增長(zhǎng)的領(lǐng)域，通過基因治療可實(shí)現(xiàn)疾病的治療或預(yù)防。其中，重組腺相關(guān)病毒(rAAV)是目前基因治療領(lǐng)域研究較多的一類病毒載體。
腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一，一般，研究中采用的重組腺相關(guān)病毒載體（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的基因載體，由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣、擴(kuò)散能力強(qiáng)、體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長(zhǎng)等，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
目前，rAAV的準(zhǔn)確定量分析和表征的難度是阻礙基因治療快速發(fā)展的關(guān)鍵因素。我們常常需要對(duì)rAAV進(jìn)行綜合全面表征，比如衣殼數(shù)量、實(shí)心率、顆粒尺寸、聚集體比例等。傳統(tǒng)情況，rAAV滴度和病毒載量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。但這些方法通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且精確度不高。
本文通過GPC/SEC和多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）兩種分析技術(shù)分析rAAV5樣品，展示了快速、準(zhǔn)確和可靠地定量測(cè)量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和實(shí)心率(% full AAV)的方法。
 
01儀器參數(shù)
OMNISEC GPC/SEC多檢測(cè)器系統(tǒng)非常適合于生物醫(yī)藥行業(yè)，可用于全面表征rAAV樣品。OMNISEC包含一個(gè)示差折光檢測(cè)器(RI)，紫外線全波長(zhǎng)陣列檢測(cè)器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射檢測(cè)器，僅需一次進(jìn)樣，可精確測(cè)量絕對(duì)分子量、聚集體比例、病毒滴度和實(shí)心率。
與傳統(tǒng)HPLC不同，測(cè)量過程不依賴柱保留體積，也不需要一系列標(biāo)樣進(jìn)行色譜柱校正。圖1顯示了使用OMNISEC測(cè)量的CQA關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)。

02檢測(cè)方法
我們采用Empty和Full rAAV5兩個(gè)樣品作為分析案例。Full rAAV5 載有已知分子量為785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。經(jīng)qPCR和ELISA測(cè)量方式可知，該樣本的病毒滴度為2.5x10¹³。
采用色譜柱P4000和P3000串聯(lián)，對(duì)rAAV樣品的進(jìn)行色譜分離。由OMNISEC軟件采集分析測(cè)試結(jié)果，其中硬件系統(tǒng)包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射檢測(cè)器）。

樣品經(jīng)過分離洗脫后，使用共聚物分析方法確定樣品兩種不同組分的濃度和分子量。計(jì)算方法如下：

其中，Conc_Capsid是衣殼濃度(mg/mL)，NA是阿伏伽德羅數(shù)，Mw_capsid是衣殼的分子量(g/mol)，Conc_DNA是DNA濃度(mg/mL)，MwSeq_DNA是來自序列的ssDNA的分子量。因此，通過計(jì)算出的顆粒濃度，可以很容易地得出樣品實(shí)心率的百分比。
 
03檢測(cè)結(jié)果
案例一：
圖2顯示了Empty rAAV5的三檢測(cè)色譜圖。RI信號(hào)由紅色曲線表示，260 nm紫外信號(hào)由紫色曲線表示，直角光散射(RALS)信號(hào)由綠色曲線表示。樣品包含四個(gè)部分：?jiǎn)误w峰保留體積(RV)在12.5ml，碎片在16ml ，二聚體在10.5ml ，聚集體在8.5ml 。使用共聚物分析方法，可以得到表1結(jié)果。

單體的分子量為3.84×10⁶g/mol。衣殼的理論分子量為3.8×10⁶g/mol，證實(shí)分析結(jié)果與預(yù)期相符。
M_W/M_n為分子量分布，描述了樣品的分散性，單體和二聚體的值接近1，而聚集體和片段均顯著高于1，表明在同一峰內(nèi)有多個(gè)不同分子量的組分。
Fraction of Sample表示樣品組分百分含量，單體所占百分比為84.7%。
Fraction of Protein顯示了樣品中衣殼的百分比，單體包含99.8%的衣殼。這證實(shí)了樣本確實(shí)是Empty rAAV5。
最后Empty rAAV5樣品總滴度為5.91x10¹³Vp/ml。
 
案例二：
第二個(gè)樣品Full rAAV5的三檢測(cè)器色譜圖如圖3所示。圖中顯示了與Empty rAAV5截然不同的色譜峰。分析色譜圖可以看出，只包含兩個(gè)不同的組分，其中單體峰，大概12.5ml RV處，包含F(xiàn)ull 和Empty rAAV5的混合物，而聚集體出現(xiàn)在8ml RV處。測(cè)試結(jié)果見表2。

對(duì)于主體的單體峰，計(jì)算出其混合物分子量為4.49×10⁶g/mol，其中86%為衣殼。rAAV5的蛋白質(zhì)組分的分子量為3.89×10⁶g/mol，這與表1中Empty rAAV5 的數(shù)據(jù)一致。單體是總體的93.2%，樣本的總滴度為7.48x10¹³VP/ml。其中單體包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5。需要注意的是，這種分析方法假設(shè)樣品要么是Full ，要么是Empty ，忽略部分裝載或過度裝載情況。
Zetasizer Ultra納米粒度及電位儀可以使用MADLS方式快速確定病毒滴度。從OMNISEC獲得的數(shù)據(jù)與Zetasizer Ultra的粒子滴度進(jìn)行了比較，兩種技術(shù)之間有很好的相關(guān)性，見圖4。

另外，本文將Full rAAV5和Empty rAAV5以確定比例混合，來對(duì)Full rAAV5樣品進(jìn)行分析。表3顯示了每個(gè)樣品的預(yù)期值和實(shí)際值Full rAAV百分比。圖5顯示了期望值和實(shí)際值之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，證實(shí)了OMNISEC確定樣品實(shí)心率結(jié)果的可靠性。

為了進(jìn)一步評(píng)估OMNISEC對(duì)rAAV樣品準(zhǔn)確表征能力，我們進(jìn)行了rAAV5樣品的熱應(yīng)力穩(wěn)定性研究，同時(shí)，基于ZS Ultra對(duì)聚集體的極高靈敏度，我們利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集體的微小變化。測(cè)試條件是將rAAV5樣品置于25^oC到80^oC之間進(jìn)行測(cè)試。

在不斷加熱過程中，在每個(gè)溫度下測(cè)量rAAV5樣品的粒徑。在25^oC和35^oC之間，沒有觀察到粒徑的變化。從35^oC開始，可以觀察到粒徑開始增大，這表明樣品開始發(fā)生變化(圖6A)。30^oC和45^oC下的數(shù)據(jù)比較清楚地顯示了這些樣品之間的大小差異(圖6B)。我們選擇45^oC條件，對(duì)OMNISEC進(jìn)行進(jìn)一步穩(wěn)定性研究。
將rAAV5樣品在穩(wěn)定在45^oC，分別在2min 、5min、10min和15min后，取樣品到OMNISEC上測(cè)試。圖7色譜疊加圖顯示樣品發(fā)生了明顯的變化，聚集體百分含量增加，單體濃度含量降低。表4顯示M_W在此潛伏期內(nèi)保持穩(wěn)定，單體峰中的AAV百分比也保持穩(wěn)定。

結(jié)論：
在這項(xiàng)研究中，我們展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在綜合分析表征rAAV5樣品的能力，以及將兩者聯(lián)合使用的應(yīng)用價(jià)值。 
OMNISEC多檢測(cè)SEC系統(tǒng)將示差折光檢測(cè)器、紫外全波長(zhǎng)檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器集成一體化設(shè)計(jì)，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，通過一次進(jìn)樣分析，可提供各種血清型AAV樣品的絕對(duì)分子量、衣殼大小、滴度、實(shí)心率、聚集體、片段和樣品穩(wěn)定性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。雖然這些參數(shù)中很多都可以使用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法來確定，但OMNISEC提供了更為簡(jiǎn)單、可靠的方法，正逐漸成為一種表征分析AAV通用的技術(shù)工具。