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背景：佐劑是基于重組蛋白的現(xiàn)代疫苗的關(guān)鍵組成部分，這些疫苗通常免疫原性很差，沒(méi)有其他免疫刺激劑。水包油乳劑包含一類高級(jí)的疫苗佐劑，它們是批準(zhǔn)的季節(jié)性和大流行性流感疫苗的組成部分。但是，很少有報(bào)道系統(tǒng)地評(píng)估不同乳液組分的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)佐劑作用。

目標(biāo)：為了評(píng)估不同均質(zhì)次數(shù)下，粒徑的分布情況，均質(zhì)三次是否可以滿足要求。

方法：通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)制備乳液，并通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射，電鏡測(cè)試相關(guān)的結(jié)果。

結(jié)果：我們證明了均質(zhì)三次，結(jié)果已經(jīng)達(dá)到了預(yù)期，但是仍然有明顯的大顆粒的存在。

結(jié)論：通過(guò)微射流均質(zhì)機(jī)可以制備質(zhì)量較好的疫苗佐劑，水包油乳劑可以顯著增強(qiáng)針對(duì)大流行性流感抗原的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：微射流均質(zhì)機(jī)；納米粒度儀；水包油乳劑；大流行性流感；疫苗佐劑;

1 疫苗佐劑綜述

疫苗接種的目的就是要獲得對(duì)疾病持久的免疫保護(hù)反應(yīng)。 與弱毒疫苗不同，滅活疫苗或亞單位疫苗通需要疫苗佐劑的參與才能更好的發(fā)揮作用?！白魟币淮蝸?lái)自于拉丁語(yǔ)“ Adjuvare ”一詞，為“幫助”或“輔助”之意。免疫佐劑的生物作用包括：

1 抗原物質(zhì)混合佐劑注入機(jī)體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長(zhǎng)了抗原的作用時(shí)間；

2 佐劑吸附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬；

3 佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的處理；

4 可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。故免疫佐劑的作用可使無(wú)免疫原性物質(zhì)變成有效的免疫原；

5 佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助 T 細(xì)胞的作用

6 可提高機(jī)體初次和再次免疫應(yīng)答的抗體滴變；

7 改變抗體的產(chǎn)生類型以及產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并使其增強(qiáng)。

人們正是因?yàn)橛^察到疫苗接種位點(diǎn)處形成的膿腫協(xié)助機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)特異性抗原更強(qiáng)的免疫反應(yīng)， 從而形成了疫苗佐劑的理念。與接種抗原不相關(guān)的物質(zhì)形成的膿腫壞死也能增強(qiáng)疫苗的特異性免疫反應(yīng)。

油乳劑佐劑繼鋁鹽類佐劑后用于人用疫苗佐劑，包括水包油或油包水乳劑，如，弗氏不完全佐劑， Montanide系列，佐劑 65。通過(guò)在接種位點(diǎn)形成抗原貯存庫(kù)降低抗原的釋放速度， 以及刺激產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞發(fā)揮佐劑效應(yīng)。

油乳劑的副作用主要包括在接種位點(diǎn)處形成炎癥反應(yīng)，肉芽腫以及潰瘍。為了篩選出更穩(wěn)定，毒性更小的油乳劑，已經(jīng)對(duì)不同來(lái)源的多種天然油進(jìn)行了評(píng)估。水包油和油包水疫苗佐劑是繼弗氏不完全佐劑發(fā)展起來(lái)的油乳佐劑，更加穩(wěn)定，毒副作用也更小。

2 材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

中試型高壓微射流均質(zhì)機(jī)（PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)，意大利PSI均質(zhì)機(jī)公司），配備75微米（E102D，G10Z）孔徑“Y型”通道金剛石交互容腔（均質(zhì)腔）。納米粒度及Zeta電位儀（Z3000納米粒度及Zeta電位儀，美國(guó)PSS公司）。

2 實(shí)驗(yàn)材料：

聚山梨酯80，泊洛沙姆188，甘油，緩沖液，山梨糖醇三油酸酯，卵磷脂酰膽堿，α-生育酚。

3 實(shí)驗(yàn)步驟：

通過(guò)水相和油相分開(kāi)制備來(lái)制備所有乳液制劑。在攪拌下將聚山梨酯80，泊洛沙姆188，甘油和緩沖液組分溶解在水相中，而將山梨糖醇三油酸酯，卵磷脂酰膽堿和α-生育酚在超聲處理和加熱下溶解在油相中。然后Silverson實(shí)驗(yàn)型混合機(jī)乳化劑將水相和油相以1000 g混合10分鐘（得到粗乳液。通過(guò)PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)將粗乳液在207 MPa（30000 psi）下均質(zhì)3遍（圖示一），水浴溫度設(shè)置為室溫，測(cè)試粒徑變化情況。 

圖示一：A).本實(shí)驗(yàn)所用PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)圖片。B).金剛石交互容腔內(nèi)部概覽圖，孔徑為75微米。C).交互容腔內(nèi)部剖面圖，剪切率約為2×106/秒。

3 試驗(yàn)結(jié)果

使用Z3000納米粒度儀分別測(cè)試均質(zhì)3次的粒徑變化，均質(zhì)次的粒度為：163.9nm、150.5nm、135.8nm，結(jié)果如下（圖示二）。

圖示二  A：均質(zhì)第一次的粒徑結(jié)果，B均質(zhì)第二次的粒徑結(jié)果，C均質(zhì)第二次的粒徑結(jié)果，D均質(zhì)三次結(jié)果對(duì)比，E電鏡結(jié)果

從結(jié)果中可以看出均質(zhì)三次后粒徑發(fā)生了很大的變化，從電鏡結(jié)果中可以看出，均質(zhì)三次的樣品有明顯的大顆粒的存在，所以均質(zhì)三次還是不夠的，通常情況下仍要增加均質(zhì)次數(shù)來(lái)達(dá)到更好的粒徑結(jié)果，查詢相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同的乳化劑對(duì)于粒徑的影響很大，較好的配方能夠在減少的均質(zhì)次數(shù)的情況下獲得更小更好的粒徑分布，并且存儲(chǔ)時(shí)間更長(zhǎng)，這些還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去論證。

4 結(jié)論

通過(guò)PSI-20微射流均質(zhì)機(jī)可以在較短的時(shí)間內(nèi)制備出較好的疫苗佐劑，粒徑結(jié)果較好。水包油型流感抗原佐劑能有效地增加免疫廣度，降低所需抗原劑量。為了充分發(fā)揮這些佐劑在各種環(huán)境下的潛力，穩(wěn)定性和替代成分可能更便宜或更容易獲得是重要的考慮因素。在實(shí)驗(yàn)中得到的顆粒大小結(jié)果也是一個(gè)很好的參考意義，這對(duì)于發(fā)展中國(guó)家有很好的指導(dǎo)作用。PSI和PSS可以很好的滿足這一實(shí)驗(yàn)的測(cè)量。