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【瑞士步琦】【應用】利用步琦SFC系統(tǒng)純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因

步琦 2024-11-07 | 閱讀：268

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利用步琦SFC系統(tǒng)純化

阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因

SFC應用

簡介

化學合成常伴有雜質(zhì)，因產(chǎn)率很少達 100%，雜質(zhì)會嚴重影響藥物療效、安全和質(zhì)量，所以純化藥物保障其純度和完整性至關重要，在現(xiàn)代藥物研發(fā)的過程中往往通過色譜法等多種方法純化。

在上一篇應用文章《利用步琦 SFC 系統(tǒng)純化利多卡因與乙酰氨基酚》中，我們使用超臨界流體色譜（SFC）高效純化了利多卡因和乙酰氨基酚的合成產(chǎn)物。在此過程中，我們先使用步琦獨有的 Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)快速篩選了色譜柱，之后將其放大到 BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)上。本次應用中，我們依舊會使用同樣的工作流程去純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因的合成產(chǎn)物。

實驗設備

BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm
HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×10mm

化學品與樣品

化學品：

二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中 2M 的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水

為了安全處理，請注意所有相應的MSDS！

樣品：

普魯卡因合成產(chǎn)物
阿司匹林合成產(chǎn)物
苯佐卡因合成產(chǎn)物

程序設定

BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜柱系統(tǒng)

流動相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動相條件：

0 – 0.5 min		5 % B
0.5 – 8.0 min		5 – 50 % B
8.0 – 9.4 min		50 % B
9.4 – 9.5 min		50 – 5 % B
9.5 – 10 min		5 % B

篩選運行完全自動運行，流速設置為 3mL/min 每通道，使用流控單元，平衡每一根色譜柱。樣品自動注入（V=5μL），并開始平行篩選（運行時間=10min）。背壓調(diào)節(jié)器設置為 150 bar，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。

BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)

流動相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動相條件：等度運行條件
檢測：紫外

所有 10mm ID 色譜柱都在預設流速下平衡 3 分鐘，使用自動進樣器上樣，并開始運行。背壓調(diào)節(jié)器設置為 150 bar，柱子加熱至 40℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。

結(jié)果

5.1 阿司匹林

阿司匹林，化學名為乙酰水楊酸（下稱 ASA），是一種眾所周知的鎮(zhèn)痛和抗炎藥物。它屬于非甾體抗炎藥（NSAIDs）這一類?？梢酝ㄟ^將水楊酸（下稱 SA）與乙酸酐發(fā)生酯化反應而化學合成（見圖5） [1] 。為了確定乙酰水楊酸的理想分離選擇性，首先進行了色譜柱柱篩選（見圖1）。

▲ 圖 1：頂部：阿司匹林合成的反應方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運行時間 = 10分鐘。

由于 SA 在固定相中的保留性較高，為了強制洗脫 SA，在梯度中增加了一個等度步驟，即在 50% 改性劑濃度下進行 5 分鐘的等度洗脫。在 HILIC 相中，ASA 和 SA 只有噪音而無洗脫。在 PEI 相中，在實驗條件下只有 ASA 被洗脫。除氰基相外，其余各相均顯示出 ASA 和 SA 的分離。結(jié)合分離時長和分辨率而言，2-EP 相的結(jié)果最好（見表 1）

▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序

選擇 2-EP 相作為固定相，放大至制備規(guī)模。在色譜柱篩選的過程中，ASA 和 SA 在 2-EP上被洗脫的甲醇比例為 26 - 40%。圖 2（上）顯示了在甲醇比例為 40% 的10x250mm 2-EP 色譜柱上純化 ASA 和 SA 的情況。改性劑中添加了甲酸（0.5%），以改善 SA 的峰形。在不添加甲酸的情況下，SA 的拖尾非常嚴重。在相同條件下，可采用疊加進樣法自動純化 ASA（見圖2下），并進行餾分收集。

▲ 圖 2：ASA 純化的單次進樣（上圖）和疊加進樣（下圖）；運行條件：流速 = 30 mL/min，改性劑 = 甲醇 + 0.5 % 甲酸，改性劑 % = 40 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進樣量 = 200 μL，紫外波長 = 254 nm；疊加進樣條件：進樣次數(shù) = 10，疊加時間 = 2.0 min，餾分 = 1（基于時間）。

5.2 苯佐卡因

苯佐卡因（下稱 BC），化學名為對氨基苯甲酸乙酯，屬于局部麻醉劑類。它可以從對氨基苯甲酸（下稱 PABA）通過酸催化羧基與乙醇的酯化反應化學合成，用硫酸作為催化劑 [2]。首先進行色譜柱篩選，以確定苯佐卡因合成產(chǎn)物理想的分離選擇性（見圖3）。

▲ 圖3：頂部：苯佐卡因合成反應方程式，底部：Sepmatix 8x SFC儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運行時間 = 15分鐘。

由于 PABA 在固定相中的保留性較強，因此在梯度中增加了一個等度步驟，在 50% 甲醇的條件下運行 5 分鐘，硫酸通過洗滌步驟去除避免過高的酸性。各固定相的色譜圖顯示，每種固定相都能分離苯佐卡因，但是洗脫速度和分辨率存在很大差異（見表2）。HILIC 和氨基相的分辨率最高，但 PABA 的保留時間過長，即使用50%的甲醇洗脫，依舊需要很長時間。

▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序。

結(jié)合柱篩選結(jié)果，最終選擇二醇基相作為制備色譜柱。HILIC 和氨基相需要較高比例的甲醇和較長的運行時間。二醇基相不僅可以非常快速地洗脫樣品，并具有足夠高的分辨率。二醇基柱的篩選結(jié)果表明，BC 和 PABA 在甲醇比例為 30 - 40% 時即可洗脫。

圖 4（上圖）顯示了 10 x 250mm 的二醇基色譜柱在甲醇比例為 28% 時對苯佐卡因的純化情況。在相同條件下，可采用疊加進樣法自動純化 BC（見圖4下），并進行餾分收集。

▲ 圖 4：苯佐卡因的單次注射（頂部）和堆疊注射（底部）純化；運行條件：流速 = 20 mL/min，改性劑 = 甲醇，改性劑 % = 28%，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，注射量 = 90 μL，UV 波長 =276nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) =12，堆疊時間 =0.66min，餾分 =1（基于時間的）。

5.3 普魯卡因

普魯卡因（下稱 PC），化學名為 4-氨基苯甲酸 2-(N, N-二乙基氨基)乙酯，是一種藥物，具有局部麻醉作用。它阻斷電壓依賴性鈉離子通道，從而導致例如疼痛敏感性的降低。普魯卡因可以通過化學方法在堿性條件下從 4-氨基苯甲酸乙酯（下稱ABE）合成。這涉及到使用 2-二乙基氨基乙醇進行酯交換[3]。堿是乙醇鈉醇，它可以通過鈉與乙醇的反應產(chǎn)生。為確定普魯卡因合成產(chǎn)物純化的理想選擇性，進行了色譜柱篩選（見圖 5）。

▲ 圖5：頂部：普魯卡因合成的反應方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；運行時間 = 15分鐘。

由于普魯卡因在固定相中的保留性較高，因此在梯度中增加了一個等度步驟，即在 50% 甲醇濃度下進行 5 分鐘的梯度。結(jié)果顯示，每種固定相對普魯卡因的純化都有合適的選擇性（見表3）。普魯卡因在硅膠、PEI 和氰基固定相中的保留性較高。

由于普魯卡因的基本特性，在部分色譜柱上的峰形非常不對稱。二醇基相下的峰前沿非常明顯，不對稱度系數(shù)為 0.58，而硅膠相下的拖尾非常明顯，不對稱度系數(shù)為 2.73。

▲ 表3：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序。

結(jié)合柱篩選結(jié)果，選擇 2-EP 相放大為制備純化的方法。硅膠相需要高含量的甲醇才能洗脫出 PC，導致運行時間長，峰形不佳。而 2-EP 相既可以快速洗脫樣品，又具有足夠高的分辨率。為了改善峰型，在甲醇改性劑中加入 5 % 的去離子水和 20 mM 的氨水作為添加劑。

篩選結(jié)果表明，PC 和 ABE 在改性劑含量約為 24 - 32% 時可以從色譜柱內(nèi)洗脫下來。圖6（上圖）顯示了10 x 250mm 的 2-EP 色譜柱在改性劑含量為 25% 時純化 PC 的情況。在相同條件下，可采用疊加進樣法自動純化 PC（見圖6，下圖）并收集餾分，添加添加劑可顯著改善 PC 的峰形。

▲ 圖 6：普魯卡因純化的單次進樣（上圖）和疊加進樣（下圖）；運行條件：流速 = 20 mL/min，改性劑 = 甲醇/水（95/5 %）加 20 mM 氨水，改性劑 % = 25 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進樣量 = 100 μL，紫外波長 = 220 nm；疊加進樣條件：進樣次數(shù) = 10，疊加時間 = 1.1min，餾分 = 2（基于時間）。

結(jié)論

超臨界制備色譜純化合成產(chǎn)物高效快速，但需篩選合適的色譜填料。BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)可快速篩選填料并放大至制備規(guī)格，既能提高樣品分離度，又能充分利用色譜柱上樣量，為 BUCHI Sepiatec SFC-50 制備系統(tǒng)的疊加進樣奠定良好基礎，二者結(jié)合可達到降本增效的目的。

參考文獻

Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-pr?parativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).